李澤華，杜 娟，賀學(xué)嬌，趙樹堂，劉穎麗，盧孟柱＊

(1. 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

油菜素內(nèi)酯（BRs）作為一種重要的植物激素，存在于植物的各個器官中[1]參與植物幼苗生長、細(xì)胞伸長、細(xì)胞壁形成等許多生長發(fā)育過程[2-3]，并且參與了植物對干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫的響應(yīng)[4]。

目前，關(guān)于BRs的生物合成途徑已研究的較為清楚。Fujioka等人通過懸浮培養(yǎng)的長春花（Catharanthus roseue（Linn.) G.Don)細(xì)胞系統(tǒng)，以油菜甾醇（CR）作為BRs合成的起始物闡明了BRs合成的基本途徑[5-6]。通過對擬南芥突變體的研究表明，在BRs的合成過程中有幾個比較重要的基因參與。DET2（DEETIOLATED2）基因表達(dá)合成一個5α-還原酶（5α-reductase），可以將油菜甾醇（（24R）-24-methylcholest-4-En-3-one）轉(zhuǎn)變?yōu)橛筒绥尥榇迹ǎ?4R）-24-methyl-5alpha-cholestan-3-one）[7-8]。擬南芥DET2基因功能缺失突變體det2-1中，植物無法合成BRs，表現(xiàn)出植株矮小、葉色深綠、根明顯縮短等表型[9]。DWF4（DWARF4）基因和BR6ox（BR-6-oxidase1）基因也被認(rèn)為是BRs合成的關(guān)鍵基因，在擬南芥突變體中具有和det2-1相似的表型[10-11]。

楊樹作為研究木本植株生長發(fā)育的模式樹種，研究BRs在楊樹生長發(fā)育中的作用和機(jī)制對于BRs的研究和分子育種都有重要的理論指導(dǎo)意義。目前，在楊樹中過量表達(dá)BR6ox基因和DWF4基因已有報(bào)道，均有引起楊樹增高增粗等表型[12-13]。關(guān)于楊樹DET2基因功能的研究，此前已有一些報(bào)導(dǎo)。鄧偉等人、譚玉朋、嚴(yán)飛通過在楊樹中異源表達(dá)棉花GhDET2基因，分析了對楊樹生長發(fā)育的影響[14-16]。目前，關(guān)于在楊樹中過量表達(dá)其自身DET2基因的研究還未見報(bào)導(dǎo)，關(guān)于過量DET2基因是否可以提高植物內(nèi)源油菜素內(nèi)酯的研究也未見報(bào)導(dǎo)。本研究從銀腺楊 84K（Populus alba×P.glandulosa，‘84K’）中分離出擬南芥AtDET2同源基因PagDET2，構(gòu)建PagDET2過量表達(dá)載體，并通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得過量表達(dá)PagDET2的轉(zhuǎn)基因楊樹，對其生長、發(fā)育進(jìn)行分析，為研究DET2在楊樹生長發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的楊樹材料均為銀腺楊84K，為中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)所用楊樹均由組培苗擴(kuò)繁而來，并由組培苗移栽至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。將帶有頂端的組培苗嫩莖（約2.5 cm）扦插到生根培養(yǎng)基（1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0.05 mg·L-1IBA 和 0.02 mg·L-1NAA，0.5%瓊脂粉，pH 5.8～6.0），培養(yǎng)于人工氣候室（溫度為23～25 ℃，光周期為14 h/10 h光照/黑暗，光照強(qiáng)度為 50 μmol·m-2·s-1）。生長 20 天后，將其移栽到營養(yǎng)土中，在22 ℃長日照（14 h/10 h光照/黑暗）培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。

本研究所使用的Gateway入門載體pDNOR207、過表達(dá)載體pMDC32、GUS組織表達(dá)分析載體pMDC164、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 及農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌種均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR引物合成和序列測序由Invitrogen公司完成。PCR反應(yīng)用的2倍濃度的Premix高保真酶Primer STAR HS、普通擴(kuò)增酶PCRMix、DNA marker、膠回收試劑盒（TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit）均為Takara公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成及RT-qPCR分析采用QIAGEN公司RNA提取試劑盒（RNeasy mini kit），并按照說明書提取RNA。RNA濃度和質(zhì)量分別用 Nanodrop8000（Thermo Fisher Scientific）和瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa）并按照說明書操作，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

在Roche 480定量儀器，使用SYBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa）上進(jìn)行RT-qPCR分析，ACTIN基因作為內(nèi)參，每個樣品進(jìn)行4個技術(shù)重復(fù)。

1.2.2PagDET2基因的克隆 以擬南芥AtDET2基因?yàn)槟康幕?，在毛果楊（Populus trichocarpa）基因組數(shù)據(jù)庫（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中 Blast獲取AtDET2同源基因PtDET2（Potri.016G110600）序列。使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer設(shè)計(jì)PtDET2基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS區(qū)）特異引物（PagDET2-F和PagDET2-R）（表1），以84K楊cDNA為模板，利用高保真聚合酶Prime STAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因PagDET2，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在線分析84K楊DET2蛋白的基本理化性質(zhì)。利用NCBI蛋白結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析PagDET2蛋白結(jié)構(gòu)和功能。利用NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和植物基因組網(wǎng)站（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）查找獲取不同物種中DET2氨基酸序列。使用DNAMAN軟件比對不同物種中DET2蛋白氨基酸序列，并分析保守結(jié)構(gòu)域[17]。使用軟件MEGA 6利用N-J法構(gòu)建不同物種的DET2蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

五六年級的孩子已開始步入青春期，開始對異性有一些朦朦朧朧的感覺。這說明孩子長大了，對自己的性別有了認(rèn)同，對異性也產(chǎn)生了認(rèn)識欲望，這是很正常的事。但我認(rèn)為“談戀愛”三個字用在他們身上還不合適，頂多就是對異性的一種好感，一種認(rèn)同。該如何疏導(dǎo)呢？說重了，怕給他們造成心理陰影，說輕了，反而使他們對異性更加好奇，說不定，還會影響其他孩子。思前想后，我決定從小雨身上找突破口。

表 1 PCR擴(kuò)增所用引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.2.4 基因表達(dá)組織特異性分析 利用半定量PCR方法對DET2在84K楊各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。以84K楊各組織的cDNA為模板，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)條帶亮度判斷DET2基因在各組織中的表達(dá)情況。

1.2.5 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 利用Gateway技術(shù)，將PagDET2基因連接至入門載體pDNOR207上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗(yàn)證后，重組至過表達(dá)載體pMDC32中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗(yàn)證。

將構(gòu)建好的過表達(dá)載體pMDC32-DET2電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化84K楊。具體遺傳轉(zhuǎn)化方法見文獻(xiàn)[18]。得到的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR檢測，并提取RNA對PagDET2基因進(jìn)行RT-qPCR定量分析。選擇表達(dá)量較高的3個過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.6 植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯濃度測定 每個株系各選3株在營養(yǎng)土中生長2月的楊樹苗，取其1至3節(jié)間，迅速放入液氮凍存，冷凍研磨后按比例加入PBS（磷酸緩沖液，pH 7.4）。使用植物（Plant）油菜素內(nèi)酯（BR）ELISA檢測試劑盒（綠源伯德生物公司，北京）測定油菜素內(nèi)酯含量，每個樣本進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，并按照說明操作[13]。

1.2.7 植物生長量及耐鹽性、抗旱性研究 在不同年份不同批次分別選取野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊#1各9株，在營養(yǎng)土中培養(yǎng)75天，測量株高，并重復(fù)3次。

選取野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊#1各10株，在營養(yǎng)土中培養(yǎng)2個月用于耐鹽性和抗旱性分析，其中高鹽實(shí)驗(yàn)各使用5株，干旱實(shí)驗(yàn)各使用5株，并重復(fù)3次。在耐鹽實(shí)驗(yàn)中，以300 mmol·L-1的NaCl水溶液處理植物，連續(xù)處理10天，持續(xù)觀察；在抗旱實(shí)驗(yàn)中，首先給予充足水分，隨后進(jìn)行持續(xù)干旱處理6天，持續(xù)觀察。以正常澆水的植株作為對照組。過氧化氫檢測使用過氧化氫檢測試劑盒（碧云天，上海），并按照說明書操作。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 PagDET2基因克隆和序列分析

以84K楊cDNA為模板，使用特異引物PagDET2-F和PagDET2-R通過PCR擴(kuò)增獲得84K楊DET2基因編碼區(qū)序列，并命名為PagDET2基因。序列分析表明，PagDET2基因與毛果楊PtDET2核酸序列相似度達(dá)97.93%，蛋白序列相似度達(dá)96.89%。PagDET2基因編碼區(qū)全長774 bp，編碼一個長度為257個氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白分子量約為29.84 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為9.49。PagDET2蛋白序列中含有兩個5α-還原酶（5α-reductase）必需的谷氨酸[19]，分別為Glu（56）和Glu（199）[20-21]（圖1），利用NCBI進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析表明為一種固醇類還原酶DET2（steroid reductase DET2）。

構(gòu)建基于84K楊、毛果楊、擬南芥、水稻等植物DET2蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，DET2蛋白的進(jìn)化在高等植物中主要分為單子葉植物和雙子葉植物兩個類群。84K楊DET2與毛果楊、擬南芥等雙子葉植物DET2同屬于一個系統(tǒng)發(fā)育分支，親緣關(guān)系較近，而與水稻、玉米等單子葉植物DET2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與形態(tài)學(xué)分類相一致。

2.2 基因表達(dá)組織特異性分析

為了研究PagDET2基因的組織表達(dá)情況，分別取84K楊根、未完全展開的嫩葉、成熟葉、中間節(jié)間和正在伸長的1至3節(jié)間提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行半定量PCR檢測。結(jié)果表明，PagDET2基因在84K楊各個組織中均有表達(dá)，且在1至3節(jié)間（In1-3）、中間節(jié)間（S）和嫩葉（YL）表達(dá)量較高，在根（R）和成熟葉片（ML）中表達(dá)量較低。PagDET2基因作為油菜素內(nèi)酯合成的必須基因，參與了植物頂端生長、葉片成熟、木材形成等生長發(fā)育過程（圖3）。

圖 1 基于不同物種中DET2同源蛋白序列的比對分析Fig. 1 Multiple sequence alignment of DET2 amino acid sequence in different plants

圖 2 基于不同物種中DET2同源蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed on the basis of DET2 amino acid sequence

圖 3 楊樹中PagDET2基因在各組織中的表達(dá)情況（YL：嫩葉，ML：成熟葉，S：中間節(jié)間，In1-3：1至3節(jié)間，R：根）Fig. 3 Expression patterns of PagDET2 in poplar（YL,young leaves; ML, mature leaves; S, middle internode;In1-3, internode 1st to 3rd; R, root）

2.3 轉(zhuǎn)基因楊樹的轉(zhuǎn)化與鑒定

為了進(jìn)一步研究PagDET2基因在楊樹生長發(fā)育中的作用，構(gòu)建了由CaMV 35S啟動子驅(qū)動的PagDET2過表達(dá)載體PagDET2-OE Vector，采用農(nóng)桿菌侵染葉盤法，獲得了過量表達(dá)PagDET2基因的轉(zhuǎn)基因株系PagDET2-OE。通過PCR克隆和RT-qPCR檢測后，選取3個表達(dá)量較高（圖4）的株系（命名為#1、#2、#3）進(jìn)行試驗(yàn)。

圖 4 PagDET2基因在PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況Fig. 4 The expression levels of PagDET2 in PagDET2-OE lines

2.4 過表達(dá)PagDET2基因?qū)顦溆筒怂貎?nèi)酯的體內(nèi)合成的影響

DET2基因作為油菜素內(nèi)酯合成過程中的關(guān)鍵限速基因，為了研究DET2基因在楊樹中的過量表達(dá)后對植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯含量的影響，通過RT-qPCR檢測了油菜素內(nèi)酯信號通路關(guān)鍵基因PtPP2A基因在PagDET2-OE株系中的表達(dá)量。結(jié)果顯示：PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊中的PtPP2A基因顯著高于野生型84K（圖5）。

圖 5 PtPP2A基因在PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況Fig. 5 The expression levels of PtEXPA8 in PagDET2-OE lines

進(jìn)一步通過ELISA檢測楊樹體內(nèi)油菜素內(nèi)酯的含量，結(jié)果顯示：與野生型84K楊對比，PagDET2-OE株系中油菜素內(nèi)酯含量顯著升高（圖6）。

2.5 過量表達(dá)PagDET2基因?qū)顦渖L發(fā)育及抗逆的影響

在人工氣候室培養(yǎng)室同時(shí)培養(yǎng)野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊，生長75天的PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊高生長明顯高于野生型84K楊（圖7）。

圖 6 PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株中的油菜素內(nèi)酯含量Fig. 6 The content of BRs in PagDET2-OE lines

為了研究PagDET2基因?qū)τ谥参锟果}、耐旱的影響，對野生型84K和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊進(jìn)行干旱和鹽脅迫。結(jié)果顯示：在未脅迫的情況之下，轉(zhuǎn)基因楊樹和野生型84K楊都能正常生長；在干旱脅迫6天后，野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊都出現(xiàn)了萎蔫、葉片卷曲、枯黃的現(xiàn)象，無明顯差別；在鹽處理8天后，野生型84K楊還能正常生長，但是PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊出現(xiàn)了蔫蔫、葉片卷曲、枯黃的現(xiàn)象（圖8）。對野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊進(jìn)行過氧化氫含量檢測，取正常生長、干旱處理3天和鹽處理4天后的葉片，液氮研磨后使用過氧化氫檢測試劑盒檢測其過氧化氫含量，結(jié)果顯示：未處理時(shí)，過氧化氫含量基本相同，干旱處理和鹽處理均會導(dǎo)致過氧化氫含量升高，但是干旱處理3天后兩者沒有明顯差別，鹽處理4天后，PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊的葉片過氧化氫含量顯著高于相同處理的野生型84K楊。

3 討論

圖 7 野生型84K（WT）和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株75天生長情況Fig. 7 75-day-old wide type（WT）and PagDET2-OE transgenic poplars

圖 8 野生型84K和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株高鹽處理8天后的生長情況Fig. 8 Wide type（WT）and PagDET2-OE transgenic poplars were treated with 300 mMNaCl for 8 days

植物激素在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面具有不可替代的作用，DET2基因作為BRs合成過程中的關(guān)鍵限速基因，對于BRs的合成有重要作用，改變其在植物體內(nèi)的表達(dá)，對于研究BRs對于植物的功能和機(jī)制有重要意義。

基因表達(dá)模式的組織分析表明，正在伸長生長的莖和已經(jīng)完成伸長生長的莖中DET2基因均有較高的表達(dá)，說明DET2可能影響莖的生長發(fā)育。過量表達(dá)楊樹DET2有增高表型，這一結(jié)果與在楊樹中異源表達(dá)棉花GhDET2基因的結(jié)果相似[14-16]。PtPP2A是AtPP2A基因的同源基因，有研究表明AtPP2A調(diào)控著BRZ1的磷酸化，BZR1是油菜素內(nèi)酯信號通路的核心，所以AtPP2A被認(rèn)為是油菜素內(nèi)酯信號通路的開關(guān)，在油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)中有重要的積極作用[1,22]。PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊中的PtPP2A基因顯著高于野生型84K，說明轉(zhuǎn)基因楊中油菜素內(nèi)酯下游信號通路可能得到了加強(qiáng)。

通過ELISA檢測植物體內(nèi)BRs的含量表明，PagDET2-OE植株中的BRs含量明顯高于野生型。且前人研究表明擬南芥DET2基因功能缺失突變體det2-1中，植物無法合成BRs[9]，說明改變DET2基因的表達(dá)量可以改變植物內(nèi)源BRs的含量，這對于進(jìn)一步研究油菜素內(nèi)酯在植物生長發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制有重要意義。DET2過量表達(dá)對于莖生長發(fā)育和油菜素內(nèi)酯信號通路基因表達(dá)量的影響可能是通過改變油菜素內(nèi)酯含量實(shí)現(xiàn)的。這一功能與BRs合成的另一關(guān)鍵基因DWF4相似，在楊樹中過量表達(dá)DWF4基因，可以促進(jìn)楊樹增高，提高BRs含量[13]。關(guān)于DET2等BRs合成中的關(guān)鍵基因的研究對利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加楊樹生物量，從而進(jìn)行定向分子育種有潛在應(yīng)用價(jià)值。

楊樹中過量表達(dá)PagDET2基因可使植株對高鹽的耐受性明顯下降。鹽處理4天后，PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊的葉片過氧化氫含量顯著高于相同處理的野生型84K楊，這從生理上明確了高表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹抗性降低的機(jī)制。雷雨婷等研究了過量表達(dá)楊樹PtDET2基因?qū)煵菰诟珊?、高鹽等處理下的影響[23]，通過在煙草中過量表達(dá)PtDET2基因，可以提高煙草抗旱、耐鹽能力。這與本研究結(jié)果有些不同，可能是由于煙草和楊樹的生長特性不同導(dǎo)致的。84K楊作為木本植物速生樹種，對分水需求很大，對高鹽和干旱更敏感。本研究觀察到的高生長轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性降低，預(yù)示著培育速生林木品種需要精細(xì)的管理，盡量避免其處于脅迫狀態(tài)。

4 結(jié)論

本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，分析了DET2基因作為BRs合成的關(guān)鍵基因在楊樹生長中的作用。結(jié)果表明，過量表達(dá)可以顯著提高內(nèi)源BRs含量，促進(jìn)植株增高，對速生品種的定向培育提供了基礎(chǔ)。但高生長植株對高鹽脅迫更具有敏感性，在林木培育中應(yīng)盡量避免逆境脅迫。