索慧英，鄭 密，盧 晗，曲冠證，李 瑩＊

(1. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150008；3. 東北林業(yè)大學(xué)林木育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

楊樹(shù)是林木遺傳研究的模式樹(shù)種[1]，是北半球種植面積最廣，適應(yīng)性最強(qiáng)的落葉闊葉樹(shù)種[2]，在我國(guó)生態(tài)建設(shè)中發(fā)揮著巨大的作用。近年來(lái)，我國(guó)楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因已取得重大進(jìn)展，主要集中在其重要的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)價(jià)值的基因功能研究上。小黑楊(Populus simonii×P. nigra)是 小 葉 楊 （Populus simoniiCarr）與歐洲黑楊（Populus nigraL.）的雜交品種，其生長(zhǎng)迅速、抗寒、抗旱性強(qiáng)，生態(tài)潛力巨大，在中國(guó)北方得到了廣泛種植[3]。近年來(lái)，對(duì)于小黑楊的研究主要集中在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)增強(qiáng)抗病性[4]、抗蟲(chóng)性[5]、耐鹽性[6-7]以及基因功能的研究[8-9]等方面，利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)小黑楊進(jìn)行研究的報(bào)道相對(duì)較少。然而，蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者[10]，執(zhí)行大多數(shù)的生物功能，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可以獲取在遺傳層面無(wú)法獲得的信息，因此，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究具有很高的價(jià)值。

蛋白質(zhì)組學(xué)的概念最初是由澳大利亞科學(xué)家Wilkins等[11]提出的，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的技術(shù)之一是雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)[12],雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)中分離蛋白質(zhì)的有效方法[13]。雙向電泳技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，如Romeo等[14]通過(guò)雙向電泳技術(shù)分析意大利楊根部響應(yīng)鋅脅迫的關(guān)鍵因素，Liu等[15]利用雙向電泳技術(shù)分析了毛果楊早期莖從初生生長(zhǎng)到次生生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)的變化。盡管雙向電泳體系優(yōu)化已有廣泛研究，但由于植物的生物學(xué)特性、生理生化特性不盡相同，對(duì)于不同植物物種，最適的電泳條件不同[16]。因此，必須針對(duì)植物的不同特點(diǎn)進(jìn)行雙向電泳體系的優(yōu)化以進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。楊樹(shù)葉片富含色素、多酚、多糖、有機(jī)酸等次生代謝物質(zhì)，對(duì)電泳過(guò)程干擾很大，導(dǎo)致雙向電泳圖譜背景高、蛋白質(zhì)不清晰，從而使楊樹(shù)葉片雙向電泳技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究受到很大的限制。因此，在進(jìn)行楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究之前，對(duì)楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳體系進(jìn)行優(yōu)化是十分重要的。

目前，關(guān)于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系優(yōu)化相關(guān)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以小黑楊葉片為材料，對(duì)雙向電泳技術(shù)中的主要影響因素進(jìn)行探討，探究出了適用于小黑楊葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳體系；該體系同樣適用于大青楊與84 K楊葉片的蛋白質(zhì)雙向電泳，因此，該雙向電泳體系可用于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，并為其他木本植物葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室內(nèi)種植的小黑楊、大青楊和84 K楊為材料。從植株上剪下長(zhǎng)20.0 cm，徑0.5～1.0 cm的枝條，并將枝條插入裝有草炭土、蛭石和珍珠巖（體積比為5:3:2）的塑料盆中。培養(yǎng)條件：溫度25～30℃，濕度70%～80%，光照16 h·d-1。扦插苗培養(yǎng)3個(gè)月后，采集自莖尖起的第3～5片葉片，將采摘下來(lái)的葉片立刻放入液氮中速凍處理，裝入樣品袋，將葉片碾碎后混合，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試劑和儀器

使用的主要藥品有二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、硫脲、尿素、十二烷基硫酸鈉、Tris base、甘氨酸均購(gòu)自 Sigma公司；IPG buffer、固相 pH梯度IPG干膠條、礦物油均購(gòu)于美國(guó)GE Helthcare公司；乙二胺四乙酸、氯化鈉、丙三醇、苯甲咪鹽酸水合物、β-甘油磷酸二鈉水合物、三氯乙酸、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺、無(wú)水乙醇、冰乙酸、硝酸銀、無(wú)水乙酸鈉、硫代硫酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、甲醛、戊二醛、考馬斯亮藍(lán)R250均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TritonX-100、溴酚藍(lán)、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺、N,N’一甲叉雙丙烯酰胺均購(gòu)自Biotopped公司；標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；其他常規(guī)試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)試劑。

使用的主要儀器有冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（蘭儀，上海），萬(wàn)分之一天平（Sartorius，德國(guó)），高速冷凍離心機(jī)離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），漩渦混合器（Crystaln，美國(guó)），制冰機(jī)（Scotaman，意大利），酶標(biāo)儀（永創(chuàng)，上海），水浴鍋（中興偉業(yè)，北京），Ettan IPGphor3 (GE Helthcare，美國(guó))，EttanDALTsix(GE Helthcare， 美 國(guó) )， ImageScanner Ш (GE Helthcare，美國(guó))，ImageMasterTM2D Platinum 7.0(GE Helthcare，美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 小黑楊葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系的優(yōu)化 本研究以小黑楊葉片為材料，對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系的2D裂解液、蛋白的純化、IPG膠條的pH范圍、蛋白上樣量、等電聚焦時(shí)間和SDS平衡時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1.1 雙向電泳裂解液的選擇 蛋白樣品提取后需要用2D裂解液重新溶解再進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選擇了2種2D裂解液溶解小黑楊葉片蛋白質(zhì) ， 即 ： 2D 裂 解 液Ⅰ （ 9.8 mol·L-1Urea， 4%CHAPS，10% DTT）和 2D 裂解液Ⅱ（7 mol·L-1Urea， 2 mol·L-1Thiourea， 4% CHAPS， 10%DTT），比較2種2D裂解液對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)分離的影響。

1.3.1.2 小黑楊葉片蛋白樣品的純化 小黑楊葉片蛋白質(zhì)提取后含有較多的多糖、多酚等非蛋白類物質(zhì)，影響雙向電泳圖譜的分辨率。為了獲得高純度的蛋白質(zhì)樣品，提高蛋白質(zhì)的分離效果，筆者對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行純化。本實(shí)驗(yàn)采用TCA-丙酮法和2D clean-up kit法對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，采用純化后的蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，比較2種方法對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)的純化效果。

三氯乙酸—丙酮（TCA-丙酮）法：取280 μL蛋白上清液于1.5 mL離心管中，加入1.4 mL-20℃保存的蛋白提取液 I（含 0.07% β-巰基乙醇，10% 三氯乙酸），上下顛倒混勻，-80℃存放2 h。12 000 g，4℃，離心20 min。棄除上清，用蛋白提取液II（含0.07% β-巰基乙醇）洗滌沉淀3次，直至沉淀呈白色。將沉淀真空干燥3～5 min，取適量 2D 裂解液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，1%DTT，4%CHAPS）溶解蛋白樣品。將樣品進(jìn)行液氮冷凍處理，-80℃冰箱保存。

2D clean-upkit（GE，美國(guó)）法：取 100 μL 蛋白上清液加入300 μL沉淀劑，混勻，冰上培育15 min；再加入 300 μL共沉淀劑，混勻；4℃，12 000 g離心5 min；離心后棄去上清液，在離心管中加入 40 μL共沉淀劑，冰浴 5 min；4℃，12 000 g離心5 min；棄上清，加入25 μL去離子水，振蕩5～10秒；加入1 mL預(yù)冷的洗滌緩沖液和5 μL洗滌添加劑，振蕩直至沉淀完全散開(kāi)，置于-20℃冰箱保存30 min；4℃，12 000 g離心5 min，將上清液移走棄去，用適量的2D裂解液溶解沉淀，4℃，12 000 g離心5 min，留取上清，將蛋白樣品液氮冷凍，放-80℃冰箱中保存以備日后分析。1.3.1.3 IPG膠條pH范圍的選擇 進(jìn)行等電聚焦前需要選擇合適的pH范圍的IPG膠條，使用不同pH范圍的IPG膠條分離小黑楊葉片蛋白質(zhì)得到的雙向電泳圖譜的分辨率不同。為了找到適用于小黑楊葉片蛋白質(zhì)分離的IPG膠條的pH范圍，本實(shí)驗(yàn)分別采用24 cm、pH 3～10和pH 4～7的線性IPG膠條進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，比較2種不同范圍的IPG膠條對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)的分離效果。

1.3.1.4 蛋白上樣量的選擇 進(jìn)行等電聚焦前筆者對(duì)蛋白上樣量進(jìn)行選擇。為了獲得能夠呈現(xiàn)更多的蛋白質(zhì)信息且分辨率較高的雙向電泳圖譜，本實(shí)驗(yàn)分別取600 μg和1 mg蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，比較2種蛋白上樣量可檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的數(shù)目和蛋白質(zhì)的分離效果。

1.3.1.5 等電聚焦時(shí)間的選擇 在等電聚焦程序的設(shè)定中，10 000 V的等電聚焦時(shí)間會(huì)影響蛋白質(zhì)的分離效果。為了獲得背景清晰，分辨率較高的雙向電泳圖譜，本實(shí)驗(yàn)對(duì)10 000 V的等電聚焦時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，比較6、11、13 h對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)的分離效果。

1.3.1.6 SDS平衡時(shí)間的選擇 等電聚焦結(jié)束后需要對(duì)膠條進(jìn)行平衡，平衡時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響雙向電泳圖譜的分辨率。為了找到合適的平衡時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了3個(gè)平衡時(shí)間，分別為：40、50、60 min，將平衡好的膠條進(jìn)行SDS-PAGE（Sodium Dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis）電泳，分析不同平衡時(shí)間對(duì)雙向電泳圖譜分辨率的影響。

1.3.2 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的建立

1.3.2.1 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片總蛋白質(zhì)的提取 參考索慧英等[17]方法。分別取小黑楊、大青楊和84 K楊葉片，每種葉片取3份，每份1 g，分別加入液氮研磨至細(xì)粉。將樣品分別轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，每份加入1.5 mL蛋白裂解液（2 mmol·L-1EDTA，137 mmol·L-1NaCl，40 mmol·L-1Tris-HCl (pH 6.8)，1 mol·L-1DTT，1%TritonX-100，10%Glycerol，0.5 mmol·L-1benzamidine，50 mmol·L-1β-glycerophosphate），充分混勻，冰浴條件下超聲破碎處理 6 min（φ2，26℃，3/9sec）；12 000 g，4℃，離心20 min；留取上清，分別將每種葉片提取出的蛋白上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，充分混合均勻后進(jìn)行液氮冷凍處理，存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片總蛋白質(zhì)的純化 采用2D clean-upkit法對(duì)小黑楊、大青楊和84 K楊葉片總蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，操作步驟見(jiàn)1.3.1.2，其中，獲得的蛋白沉淀用2D裂解液Ⅱ進(jìn)行溶解。將蛋白樣品液氮冷凍，放-80℃冰箱中保存。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（生工，上海）測(cè)定蛋白濃度，使用牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別取濃度為1 mg·mL-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、4、8、12 μL于0.5 mL的離心管中，用去離子水分別添加至終體積為40 μL，旋渦振蕩混合均勻。分別從每管中取出20 μL溶液加入到酶標(biāo)板中，在每個(gè)孔中分別加入200 μL的Bradford工作液，吸打混勻，室溫反應(yīng)5 min。使用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)為595 nm的吸光值，以不同BSA含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將待測(cè)蛋白樣品稀釋至合適濃度，按照上述操作步驟測(cè)定蛋白樣品的吸光值，記錄吸光值。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量，除以樣品稀釋液的總體積，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品的實(shí)際濃度。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值做為該樣品的濃度值。

1.3.2.4 雙向凝膠電泳 第一向等電聚焦（Isoelectric focusing，IEF），取1 mg蛋白樣品加入水化液 (9.8 mol·L-1Urea，0.002%BPB，2%IPG buffer，2%CHAPS)至總體積為 450 μL，充分混勻，將樣品自左而右線性加入到水化槽中，將24 cm、pH 4～7線性IPG膠條保護(hù)膜去除，膠面朝下緩慢的置于樣品溶液上并覆蓋礦物油，將水化槽置于等電聚焦儀中。在20℃條件下進(jìn)行等電聚焦，等電聚焦參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。

等電聚焦結(jié)束后將膠條進(jìn)行兩步平衡。第一步：將膠條置于平衡緩沖液I（75 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol·L-1Urea，30% Glycerol，2% SDS，1% DTT）中平衡40 min。第二步：將膠條轉(zhuǎn)移到平 衡 緩 沖 液 II（ 75 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol·L-1Urea，30% Glycerol，2% SDS，2.5% 碘乙酰胺）中平衡40 min。平衡結(jié)束后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠的濃度為13%，電泳條件為1 W·gel-1，電泳30 min后調(diào)整為13 W·gel-1，至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)距凝膠底部1 cm處停止電泳，將凝膠取出，進(jìn)行銀染染色。

1.3.2.5 銀染及圖像的掃描與分析 參考嚴(yán)冬等[18]方法。固定30 min，致敏30 min，漂洗3次，每次10 min；染色20 min后立即水洗2次，每次1 min；顯色至蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰后終止5 min。染色后的凝膠利用ImageScanner Ш掃描儀與ImageMasterTM2D Platinum 7.0分析軟件進(jìn)行圖像的采集與分析，分辨率為300 dpi。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黑楊葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系的優(yōu)化

2.1.1 雙向電泳裂解液的選擇 本研究比較了2D裂解液Ⅰ和2D裂解液Ⅱ?qū)Φ鞍踪|(zhì)分離的影響。選用24 cm、pH 3～10的線性IPG膠條，蛋白上樣量為300 μg，進(jìn)行雙向電泳。圖1表明：使用2D裂解液Ⅰ的圖譜（圖1a）中可檢測(cè)到117個(gè)蛋白質(zhì)，圖中蛋白質(zhì)的溶解性差，堿性端蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)少，且蛋白質(zhì)的聚焦效果不好，未能有效分離；使用2D裂解液Ⅱ的圖譜（圖1b）分辨率高，可檢測(cè)到326個(gè)蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：選用2D裂解液Ⅱ溶解小黑楊葉片蛋白質(zhì)可獲得分辨率較高的2-DE圖譜。

表 1 等電聚焦程序Table 1 The program of isoelectric focusing electrophoresis

圖 1 2種2D裂解液溶解的小黑楊葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 1 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves dissolved with two kinds of 2D lysis buffer

2.1.2 小黑楊葉片蛋白樣品的純化 本研究比較了TCA-丙酮法和2D clean-up kit法對(duì)小黑楊葉片總蛋白質(zhì)純化的效果。選用24 cm、pH 3～10的線性IPG膠條，蛋白上樣量為600 μg，進(jìn)行雙向電泳。圖2表明：采用TCA-丙酮法（圖2a）純化的蛋白樣品，可檢測(cè)到364個(gè)蛋白質(zhì)，其雙向電泳圖譜有較高的背景，蛋白質(zhì)未能有效分離且大分子量的蛋白聚焦效果較差；采用2D clean-up kit法（圖2b）純化的蛋白樣品，其雙向電泳圖背景清晰，圖譜分辨率較高，蛋白質(zhì)的整體聚焦效果好，可檢測(cè)到的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)為450個(gè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：2D clean-up kit法適用于小黑楊葉片雙向電泳蛋白樣品的純化。

2.1.3 IPG膠條pH范圍的選擇 本研究比較了pH 3～10和pH 4～7的線性IPG膠條對(duì)蛋白質(zhì)分離的效果。選用24 cm的IPG膠條，蛋白上樣量為600 μg進(jìn)行雙向電泳。圖3表明：采用pH 3～10的IPG膠條的雙向電泳圖譜（圖3a）中，小黑楊葉片蛋白主要分布在酸性端至中性區(qū)域，堿性端分布較少，可檢測(cè)到354個(gè)蛋白質(zhì)；采用pH 4～7的IPG膠條（圖3b）分離所得蛋白在凝膠上分布比較均勻，可檢測(cè)到393個(gè)蛋白質(zhì)，分離效果明顯優(yōu)于前者，更有利于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中差異蛋白質(zhì)的分離和鑒定。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小黑楊葉片中的堿性蛋白較少，主要集中在酸性端且主要分布在pH 4～7范圍內(nèi)，所以pH 4～7的IPG膠條適用于小黑楊葉片蛋白質(zhì)的分離。

圖 2 2種純化方法純化的小黑楊葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 2 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves purified by two kinds of purification methods

圖 3 不同pH范圍的IPG膠條分離的小黑楊葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 3 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves separated with different IPG pH ranges

2.1.4 蛋白上樣量的選擇 本研究對(duì)蛋白上樣量600 μg和 1 mg進(jìn)行比較，選用 24 cm、pH4～7的線性IPG膠條進(jìn)行雙向電泳。圖4表明：蛋白上樣量為600 μg的圖譜（圖4a）可檢測(cè)到393個(gè)蛋白質(zhì)；蛋白上樣量提高到1 mg（圖4b）可檢測(cè)到蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù)明顯增加，低豐度蛋白得以顯現(xiàn)，可檢測(cè)到454個(gè)蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本研究的雙向電泳體系可以對(duì)1 mg的小黑楊葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行很好的分離。

圖 4 不同上樣量的小黑楊葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 4 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves with different loading amount

2.1.5 等電聚焦時(shí)間的選擇 本研究對(duì)10 000 V的等電聚焦時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，比較了6、11、13 h條件下等電聚焦的效果。本研究選用24 cm、pH 4～7的膠條，蛋白上樣量為1 mg進(jìn)行雙向電泳。圖5表明：聚焦時(shí)間為6 h的電泳圖譜（圖5a）中，蛋白質(zhì)的聚焦不充分有水平拖帶，且蛋白質(zhì)未能有效分離，通過(guò)軟件分析可檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù)為454個(gè)；聚焦時(shí)間為11 h的圖譜（圖5b）中，可分辨的蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù)明顯增加，可檢測(cè)到510個(gè)蛋白質(zhì)，聚焦效果明顯增強(qiáng)，但仍存在水平拖尾；聚焦時(shí)間為13 h的圖譜（圖5c）中，圖像背景清晰，橫向拖帶較少，可檢測(cè)到539個(gè)蛋白質(zhì)，且膠圖中各蛋白質(zhì)圓滑清晰，聚焦情況良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：蛋白上樣量達(dá)到1 mg，10 000 V的等電聚焦時(shí)間為13 h時(shí)膠圖中蛋白點(diǎn)的聚焦效果好，所獲得的圖譜分辨率較高。

圖 5 不同聚焦時(shí)間小黑楊葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 5 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves with different IEF time

2.1.6 SDS平衡時(shí)間的選擇 本研究對(duì)平衡時(shí)間40、50、60 min進(jìn)行比較分析。本實(shí)驗(yàn)采用pH 4～7，24 cm的膠條，蛋白上樣量為1 mg進(jìn)行雙向電泳。圖6表明：平衡時(shí)間為40 min時(shí)，可檢測(cè)的蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù)為539個(gè)（圖6a）；平衡時(shí)間延長(zhǎng)至50 min時(shí)，蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù)減少，可檢測(cè)到436個(gè)蛋白質(zhì)（圖6b）；當(dāng)平衡時(shí)間延長(zhǎng)至60 min時(shí)，隨著膠條中蛋白損失量的逐漸增加，蛋白質(zhì)的顯色程度逐漸降低，可檢測(cè)到的蛋白質(zhì)為363個(gè)（圖6c）。結(jié)果表明：在小黑楊葉片蛋白質(zhì)的分離中，適宜的平衡時(shí)間為40 min。

圖 6 不同平衡時(shí)間下小黑楊葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 6 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves with different equilibration time

2.2 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的建立

本研究采用優(yōu)化后的雙向電泳體系對(duì)小黑楊（圖7a）、大青楊（圖7b）和84 K楊（圖7c）的葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，選用2D裂解液Ⅱ溶解蛋白樣品，2D clean-up kit法純化蛋白樣品，使用24 cm、pH 4～7的IPG膠條，蛋白上樣量為1 mg，10 000 V的等電聚焦時(shí)間為13 h，平衡時(shí)間為40 min進(jìn)行雙向電泳。獲得的圖譜分別可檢測(cè)到531、828和525個(gè)蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)的分離效果較好，圖譜的分辨率較高。結(jié)果表明：本研究?jī)?yōu)化的雙向電泳體系適用于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

圖 7 3種楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 7 2-DE profiles of proteins from three kinds of poplar leaf

3 討論

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在木本植物研究中的應(yīng)用

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在白樺(Betula platyphyllaSuk.)[19]、 旱柳 (Salix matsudanaKoidz)[20]、 茶樹(shù)（Camellia sinensis(L.)O. Kuntze）[21]及楊樹(shù)[15]等植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用，在推動(dòng)木本植物蛋白功能的研究與發(fā)展中起到了重要的作用。如寧德利[22]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了小黑楊頂芽進(jìn)入休眠、保持休眠及解除休眠3個(gè)階段的蛋白質(zhì)的變化，獲得了74個(gè)差異蛋白質(zhì)；張小玲等[23]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了楊樹(shù)不同種質(zhì)成熟花粉萌發(fā)的特性及致敏蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)間楊樹(shù)的花粉活力、致敏蛋白的數(shù)量及表達(dá)量存在明顯差異。對(duì)于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也有一些報(bào)道，如Kieffer等[24]研究了鎘脅迫對(duì)楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，獲得了125個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，對(duì)118個(gè)差異蛋白進(jìn)行了鑒定與分析，闡明了碳代謝與氧化脅迫機(jī)制參與楊樹(shù)葉片鎘脅迫的應(yīng)答；岳寧等[25]對(duì)胡楊（Populus euphraticaOliv.）異形葉鋸齒闊卵型以及披針形葉片蛋白質(zhì)分別進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，對(duì)圖譜比較分析后發(fā)現(xiàn)了73個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，揭示了胡楊為了適應(yīng)生存環(huán)境，葉片中蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了變化，形成了不同形狀的葉片；金鑫[26]對(duì)小黑楊葉片參與H2O2脅迫應(yīng)答的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，獲得了81個(gè)小黑楊葉片響應(yīng)H2O2脅迫的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。由于楊樹(shù)葉片中含有較多的多糖、酚類及核酸等物質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)的分離產(chǎn)生了較大的影響，導(dǎo)致在楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中獲得的差異蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù)較少，圖譜的背景較高，圖譜不夠清晰。為了進(jìn)一步獲得更多的差異蛋白質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行全面的研究與分析，對(duì)楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的。迄今為止，楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系優(yōu)化相關(guān)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，獲得高質(zhì)量的雙向電泳圖譜，在2-DE凝膠展示更多的蛋白質(zhì)是進(jìn)行后續(xù)分析的前提，因此，對(duì)楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳體系的優(yōu)化可為后續(xù)的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

3.2 適用于雙向電泳的楊樹(shù)葉片總蛋白質(zhì)的制備

在雙向電泳體系中，蛋白樣品制備的好壞直接關(guān)系到圖譜質(zhì)量的好壞。在進(jìn)行等電聚焦前需要將蛋白樣品重新溶解，確保樣品在2D裂解液中有良好的溶解性，這對(duì)獲得分辨率高且蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)多的二維凝膠圖譜是至關(guān)重要的。尿素是一種常用的離液劑，在蛋白質(zhì)的溶解中應(yīng)用較多，它可以改變或破壞蛋白質(zhì)內(nèi)部的氫鍵、疏水鍵等次級(jí)鍵的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性及蛋白酶失活[27]。硫脲是一種增溶劑，在膜蛋白的提取中應(yīng)用較多[28]，但由于其不溶于水，溶于高濃度尿素的特性，需與尿素混合使用[29]；硫脲可提高蛋白的溶解性，增強(qiáng)2-DE的效果。本研究采用尿素與硫脲聯(lián)用的2D裂解液Ⅱ溶解小黑楊葉片蛋白質(zhì)獲得了蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)多、聚焦效果較好的雙向電泳圖譜。

小黑楊葉片中富含多糖、色素、核酸等物質(zhì)，在膠圖中呈現(xiàn)出較高的背景，影響蛋白質(zhì)的識(shí)別。本研究采用TCA-丙酮沉淀法與2D clean-up kit法對(duì)獲得的蛋白樣品進(jìn)行純化，TCA-丙酮沉淀法是基于蛋白在酸和/或疏水條件下變性使蛋白濃縮并去除污染物的原理[30]，最早用于小麥蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。TCA能有效地抑制蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解作用，保證在制樣過(guò)程中蛋白質(zhì)不被降解[31]；然而，該方法的最大的缺點(diǎn)是樣品中的非蛋白成分很難去除[32]，導(dǎo)致雙向電泳圖譜有較高的背景，從而掩蓋部分蛋白質(zhì)，影響蛋白質(zhì)組學(xué)的分析。2D clean-up kit法可通過(guò)定量沉淀蛋白質(zhì)去除核酸、鹽類、脂類和酚類等干擾物質(zhì)，在苜蓿細(xì)胞壁[33]和豌豆種子[34]的蛋白質(zhì)樣品制備中已有使用報(bào)道；同時(shí)，該方法可以有效的濃縮蛋白樣品，特別適用于上樣量大的樣品。本研究通過(guò)比較2種蛋白純化方法發(fā)現(xiàn)，對(duì)于小黑楊葉片蛋白而言，采用2D clean-up kit對(duì)蛋白樣品進(jìn)行純化可有效去除雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，獲得背景清晰，分辨率較高的雙向電泳圖譜，可滿足小黑楊蛋白質(zhì)組學(xué)研究的要求。

3.3 楊樹(shù)葉片總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分辨率的提高

雙向電泳對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果主要受IPG膠條的pH范圍、蛋白上樣量和等電聚焦條件等因素的影響。選擇合適的pH范圍的膠條能提高圖譜的分辨率，通常情況下選擇pH 3～10的膠條進(jìn)行分離蛋白質(zhì)，選用較寬pH范圍的膠條，可以使雙向電泳圖譜中呈現(xiàn)更多的蛋白質(zhì)，更能全面反映植物組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；但如果膠條的pH范圍與蛋白樣品中蛋白的等電點(diǎn)范圍相差較大，則會(huì)使蛋白過(guò)于集中無(wú)法完全分離，造成部分蛋白點(diǎn)重合影響分析效果[35]。G?rg等[36-37]研究表明，使用窄pH范圍的IPG膠條分離蛋白質(zhì)樣品，可提高圖譜的分辨率,并可提高該pH范圍內(nèi)所檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的數(shù)量。在本研究中，與pH 3～10的IPG膠條相比，采用pH 4～7的IPG膠條可以分離出更多的蛋白質(zhì)。

合適的蛋白上樣量可以提高雙向電泳圖譜的分辨率。上樣量過(guò)低，低豐度蛋白難以檢測(cè)，可檢測(cè)到的蛋白質(zhì)少。提高上樣量有利于低豐度蛋白的檢測(cè)，但上樣量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生橫縱條紋，高豐度蛋白會(huì)影響其他蛋白的分離和分析[29]，蛋白質(zhì)容易凝聚或沉淀而造成損失。在膠條的長(zhǎng)度及染色方法確定的前提下，優(yōu)化上樣量對(duì)提高蛋白質(zhì)的分離效果和增加低豐度蛋白的檢測(cè)均具有重要意義。本研究中，小黑楊葉片蛋白質(zhì)的上樣量為1 mg時(shí)可以檢測(cè)到更多的蛋白質(zhì)，獲取更多的蛋白質(zhì)信息。

等電聚焦程序的設(shè)置會(huì)影響蛋白質(zhì)的分離效果，聚焦時(shí)間與膠條的長(zhǎng)度、pH范圍、兩性電解質(zhì)載體及蛋白樣品的上樣量有關(guān)[28]。聚焦不完全會(huì)造成圖譜中有大量的橫向拖尾、蛋白質(zhì)不能有效分離，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)難以確定。聚焦過(guò)度會(huì)造成橫條紋、蛋白質(zhì)的損失和蛋白質(zhì)漂移。在本研究中，采用10 000 V的等電聚焦時(shí)間為13 h對(duì)小黑楊葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,可以獲得分辨率較高的雙向電泳圖譜。

SDS平衡的主要目的是促使SDS與蛋白分子充分結(jié)合，保證蛋白分子在第二向中能夠進(jìn)行有效的遷移；平衡時(shí)間過(guò)短，蛋白沒(méi)有結(jié)合足夠的SDS，易產(chǎn)生縱向拖尾；平衡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)大量蛋白會(huì)從IPG膠條中出來(lái)進(jìn)入平衡液中，造成蛋白的損失。

4 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化后的雙向電泳體系為：采用2D裂解液Ⅱ溶解總蛋白質(zhì)，用2D clean-up kit法對(duì)總蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，選用24 cm、pH 4～7的線性IPG膠條，蛋白上樣量為1 mg，10 000 V的等電聚焦時(shí)間為13 h，SDS平衡時(shí)間為40 min。利用優(yōu)化后的雙向電泳體系對(duì)小黑楊、大青楊和84 K楊葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，分別可檢測(cè)到531、828、525個(gè)蛋白質(zhì)，得到的蛋白質(zhì)分離效果好，雙向電泳圖譜背景清晰，分辨率高，重復(fù)性好。本研究成功的建立了小黑楊、大青楊與84 K楊葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜，該體系可滿足小黑楊、大青楊與84 K楊蛋白質(zhì)組學(xué)的分析和研究，為楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。