王曉霞，楊海靈，毛建豐，王曉茹

(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083)

谷胱苷肽轉移酶（Glutathione S-transferases,GSTs; EC 2.5.1.18）是一類具有多種功能的蛋白質(zhì)超家族。最早發(fā)現(xiàn)GSTs能夠催化還原型谷胱苷肽（ GSH）的巰基與異源生物和內(nèi)生生物來源的各種不同結構化合物的親電子基團結合形成R-SG復合物，增加這些化合物的疏水性，使其易于排出細胞膜，分解之后排出體外，從而達到解毒的作用[1]；其后發(fā)現(xiàn)GST還具有連接、信號轉導等多種生理功能[2]，并將具有GSH依賴的轉移酶、過氧化物酶、異構酶和氧化還原酶以及轉運功能的蛋白定義為GST蛋白超家族成員[3]?；诨虻慕Y構、蛋白序列的相似性、關鍵氨基酸位點的保守性、底物專一性以及免疫交叉反應等特征可將GST超家族成員分為多個亞家族[4]。植物 GST可分為10 類：Tau、Phi、Lambda、DHAR、Theta、Zeta、EF1Bγ、TCHQD、Iota和 Hemerythrin[5-7]，其中，Tau類GST不僅是植物特有的亞類，也是成員最多的亞類，參與保護細胞免受各種生物和非生物脅迫[8-11]，以及光信號下細胞伸長和開花的調(diào)控[12]。

Tau GST都是以二聚體形式發(fā)揮其功能的，單個亞基大約23～30 kDa[13]。每一個亞基都包含獨立的催化部位，包括一個GSH特異結合位點（G位點），位于蛋白N端及C端結構域形成的V型區(qū)域表面，和一個結合疏水底物的位點（H位點），主要位于蛋白C端，G位點與H位點由5～10個氨基酸殘基的linker區(qū)連接。G和H位點在結合和催化底物反應時會發(fā)生構象變化，具有一定程度的可變性[14]。因此，為了保持GST蛋白催化活性，需要穩(wěn)定G位點和H位點的空間結構。

本課題組前期的研究顯示，裸子植物油松（Pinus tabulaeformis）中一個 Tau類 GST基因（PtGSTU1）在油松不同組織部位均表達，其編碼的蛋白對典型的 GST底物 1-氯-2,4-二硝基苯（ CDNB） 和 7-氯 -4-硝 基 苯 并 -2-氧 雜 -1,3-二 唑（NBD-Cl）具有高活性和較高的親和力，其蛋白的Ser13、Lys40、Ile54、Glu66和Ser67為谷胱苷肽結合（G-位點）殘基，對底物特異性和GSH的親和力具有重要作用，同時這些位點的替換能夠影響蛋白的穩(wěn)定性[15-16]。本研究中，筆者進一步探討PtGSTU1的單體穩(wěn)定性，根據(jù)蛋白三維結構模擬預測出在單體結構穩(wěn)定性中具有關鍵作用的氨基酸位點，利用定點突變對這些位點進行氨基酸分子替換，通過酶學功能檢測，解析這些位點對蛋白穩(wěn)定性的影響。

1 材料和方法

1.1 結構模擬

本研究選取了一個油松Tau類谷胱苷肽轉移酶為研究對象，利用PtGSTU1[16]的蛋白序列（GenBank No. AAT69969）進行結構模擬。利用PtGSTU1蛋白序列在 Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中搜索結構模板，使用默認參數(shù)利用SwissModel[17]進行結構模擬。

1.2 構建PtGSTU1突變體

以含有PtGSTU1編碼序列的重組載體為模板，通過PCR進行定點突變。對于Arg 18突變體，利用誘變正向引物（R18X -F）和反向引物（PtGSTU1-R）進行PCR擴增。PCR反應混合物含有10 pmol的每種引物，1 U的pfx Taq DNA聚合酶（Invitrogen Life Technologies，USA），0.3 mmol·L-1的各種 dNTP（Amersham Pharmacia Biotech，USA），1 mmol·L-1MgSO4和 1～3 ng 的模板 DNA，反應體系為50 μL。優(yōu)化的PCR條件為：94℃下變性2 min，94℃ 15 s，55℃退火30 s和68℃延伸60 s，反應30個循環(huán)，最終延伸2 min。對于103位突變體，進行兩輪PCR，第一輪PCR分別用正向引物（PtGSTU1-F）和誘變反向引物（D103A-R）、反向引物（PtGSTU1-R）和誘變正向引物（D103AF）分別進行擴增，獲得2個片段。用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（Amersham Pharmacia Biotech，USA）純化第一輪反應產(chǎn)物。第一輪PCR產(chǎn)物在目的突變位點產(chǎn)生短片段重疊區(qū)段。第二輪PCR使用正向（PtGSTU1-F）和反向（PtGSTU1-R）引物，以第一輪2個重疊的PCR產(chǎn)物為模板進行拼接。PCR反應條件與上述相同，所有引物見表1。對兩個突變位點的PCR最終產(chǎn)物使用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（Amersham Pharmacia Biotech）從1%瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物中的DNA片段。純化的DNA片段和表達載體pET30a（Novagen，Madison，WI）分別用相應的限制性內(nèi)切酶消化后進行重組。所得質(zhì)粒用于轉化大腸桿菌BL21。重組載體利 用 BigDye（ Applied Biosystems， Foster City，CA）進行測序驗證。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 重組PtGSTU1和突變體的表達和純化

將含有重組pET30a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21過夜培養(yǎng)，然后以1:100稀釋，震蕩培養(yǎng)直至光密度（A600）達到0.5；加入0.1 mmol·L-1IPTG誘導蛋白表達，并分別在37、25、20℃下繼續(xù)培養(yǎng)8 h；4℃以6 500 g離心10 min收集菌體，重懸于結合緩沖液（20 mmol·L-1磷酸鈉，0.5 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1咪唑，pH值7.0）中，低溫超聲破碎；然后將勻漿在4℃下以10 000 g離心10 min。通過SDS-PAGE分析所得沉淀和上清液。

確定成功表達可溶蛋白后，剩余的上清液上樣到已用結合緩沖液預平衡的Ni Sepharose High Performance柱（Amersham Pharmacia Biotech）上。用洗脫緩沖液（20 mmol·L-1磷酸鈉，0.5 mol·L-1NaCl，500 mmol·L-1咪唑，pH 值 7.0）洗脫與 Ni Sepharose High Performance柱結合的目的蛋白質(zhì)。使用PD-10柱（Amersham Pharmacia Biotech）對蛋白溶液進行脫鹽，脫鹽緩沖液為10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH值7.0）。

1.4 酶學活性及熱穩(wěn)定性測定

根據(jù) Habig等[1]描述的測定方法，測定GST對CDNB（1-chloro-2,4-dinitrobenzene）、ECA（ethacrynic acid）和4-NPA（4-nitrophenyl acetate）底物的催化活性。利用Ricci等[18]所述方法，測定對 NBD-Cl（ 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole）的催化活性。所有測定均在25℃下進行。根據(jù)Lowry等[19]的方法計算蛋白質(zhì)濃度。使用梯度濃度（0.1 至 1 mmol·L-1）的 GSH（glutathione）和 1 mmol·L-1的CDNB測定對 GSH的米氏常數(shù)（Km）和酶被底物飽和時的反應速度（Vmax）。使用梯度濃度（0.1至 1 mmol·L-1）的 CDNB和1 mmol·L-1的 GSH測定對 CDNB的米氏常數(shù)（Km）和酶被底物飽和時的反應速度（Vmax）。將數(shù)據(jù)繪制為雙倒數(shù)Lineweaver-Burk圖以確定Km和Vmax值。

從25～65℃，以5℃間隔的溫度梯度溫育樣品15 min后測定對CDNB的底物活性。分別對野生型（Wild type）和突變體 D103A（0.45 mg·mL-1蛋白溶于 10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 值 7.0）繪制熱穩(wěn)定性曲線。

2 結果與分析

2.1 PtGSTU1單體結構分析

用PtGSTU1蛋白序列搜索蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫，獲得最優(yōu)模板為一個節(jié)節(jié)麥Tau類GST晶體（TaGSTU4，PDB id為1 gwc）。以TaGSTU4晶體結構為模板進行同源建模，獲得模擬的PtGSTU1蛋白三維結構（圖1A）。結果發(fā)現(xiàn)，PtGSTU1單體具有典型的GST三維結構，具有N端和C端兩個結構域，其中，N端及C端結構域形成的V字型區(qū)域表面主要為第一底物GSH的特異結合位點（G位點），C端活性口袋包含結合疏水底物的位點（H位點），G位點與H位點由一段短肽連接。

圖 1 PtGSTU1蛋白結構Fig. 1 Structure of PtGSTU1

蛋白結構模型顯示，N端結構域一個精氨酸（R）位點能夠與C端結構域一個天冬氨酸（D）形成氫鍵（圖1B）。將PtGSTU1與不同植物、不同類型GST蛋白進行序列比對（圖2），發(fā)現(xiàn)PtGSTU1蛋白N端結構域的βαβαββα結構在Tau類GST中非常保守，而C末端的結構可變性較大。第18位的精氨酸在所有GST中均保守，而第103位的天冬氨酸僅在Tau類GST中保守。

圖 2 植物GST蛋白序列比對Fig. 2 Alignment of plant GST proteins

2.2 PtGSTU1及其突變體蛋白的表達

為了探討PtGSTU1蛋白R18和D103位之間氫鍵對蛋白結構穩(wěn)定性的影響，筆者對這2個位點分別單獨進行了定點突變。將18位精氨酸分別突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）、丙氨酸（A）、色氨酸（W）、賴氨酸（K）、谷氨酸（E）和組氨酸（H），構建了R18I、R18A、R18W、R18K、R18E和R18H六個突變體蛋白，并將103位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔ˋ）構建D103A突變體。這些用于替換的氨基酸殘基側鏈具有不同的極性和空間位阻。

對野生型PtGSTU1和所有突變體進行蛋白的表達檢測（圖3），分別在37、25、20℃進行蛋白的誘導表達，對收集的菌體進行破碎，破碎后分離細胞沉淀物和上清，進行SDS-PAGE檢測。檢測結果顯示：野生型和突變體蛋白分子量在32 kDa左右，與預期一致。在37℃下，6個R18突變體均為包涵體，而野生型和D103A在上清中表達。在25℃和20℃下，R18A在上清檢測到微弱的表達，其他5個R18突變體均為包涵體，野生型和D103A在上清中表達。

圖 3 PtGSTU1及其突變體蛋白表達Fig. 3 Expression of the wild type and mutants of PtGSTU1

在細胞沉淀中的蛋白多為由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，因此，6個R18突變體無法獲得高純度的具有正確折疊的可溶蛋白。為了檢測D103突變體的酶學功能變化，筆者分別對野生型和D103A突變體蛋白進行純化，利用Ni離子親和柱純化上清中表達的蛋白，以野生型蛋白為參照，純化后，重組蛋白均顯示單一條帶，在SDSPAGE上具有相同的遷移率（圖4）。

2.3 PtGSTU1及其突變體酶學功能測定

PtGSTU1蛋白R18位6個突變體的表達檢測顯示：僅R18A有微量蛋白能夠在上清中表達，但由于表達量過低，純化后無法獲得高濃度可溶蛋白進行酶學功能的檢測。為了檢測突變體是否還具有GST催化活性，筆者以含有pET30a載體的Bl21誘導表達后的上清液為陰性對照，測定R18A重組蛋白表達上清對CDNB的催化活性，結果顯示：R18A具有微弱的催化活性（OD340= 0.02）。

圖 4 PtGSTU1及D103A突變體蛋白純化Fig. 4 Expression of the wild type and mutant D103A of PtGSTU1

對純化后的D103A重組蛋白進行酶學活性檢測發(fā)現(xiàn)：103位天冬氨酸突變?yōu)楸彼岷?，其?種底物的活性明顯降低，對CDNB的催化活性僅為（1.70 ± 0.26） μmol·min-1·mg-1，與野生型相比降低了12.2倍；對NBD-Cl的催化活性為（0.45 ±0.08） μmol·min-1·mg-1， 與 野 生 型 相 比 降 低 了10.7倍，ECA降低1.1倍，對4-NPA幾乎檢測不到催化活性（表2）。

CDNB是GST經(jīng)典底物，廣泛用于GST活性的檢測，且PtGSTU1-D103A對CDNB的催化活性最高。我們使用CDNB和GSH作為底物測定PtGSTU1-D103A的動力學常數(shù)。發(fā)現(xiàn)PtGSTU1-D103A對兩個底物的米氏常數(shù)（Km）均有明顯增加，分別為 1.06 ± 0.25 mmol·L-1和 0.87± 0.17 mmol·L-1。這意味著與野生型相比，PtGSTU1-D103A對底物的親和力明顯降低。底物飽和時，PtGSTU1-D103A催化GSH和CDNB的反應速率（Vmax）降低了至少9倍。相應的，對底物的催化效率（kcat/Km）也明顯降低（表3）。

2.4 PtGSTU1及其突變體熱力學穩(wěn)定性分析

為了進一步驗證R18和D103這2個氨基酸位點間氫鍵對Tau類GST蛋白單體結構的影響，筆者分別對野生型和PtGSTU1-D103A蛋白的熱力學穩(wěn)定性進行檢測。野生型蛋白在25～50℃之間保留了90%以上的催化活性，這表明其在50℃以下是穩(wěn)定的；而PtGSTU1-D103A突變體蛋白隨溫度升高，催化活性快速降低，在30℃時僅剩約40%的催化活性，預示著其蛋白熱穩(wěn)定性較低（圖5）。

表 2 PtGSTU1野生型和D103A突變體蛋白底物活性Table 2 Specific activities of the wild type and D103A mutant of PtGSTU1 towards different substrates. The values shown are means ± S.D., calculated from three replicates

圖 5 PtGSTU1及D103A突變體蛋白的熱力學穩(wěn)定性Fig. 5 Thermal stability of the recombinant wild type and mutant D103A of PtGSTU1

表 3 PtGSTU1野生型和D103A突變體蛋白動力學。Table 3 Steady-state kinetic constants of the wild type and D103A mutant of PtGSTU1. Data are means ± S.D, calculated from three replicates.

3 討論

基于與節(jié)節(jié)麥TaGSTU4蛋白晶體結構的比較，筆者推測PtGSTU1的18位精氨酸和103位天冬氨酸能夠形成氫鍵，這個氫鍵穩(wěn)定了蛋白N端和C端的空間結構，使蛋白能夠形成正常的折疊。PtGSTU1的催化口袋位于N端和C端的空間結構之間[16]，第18位精氨酸位于α1螺旋上，這一位點在植物不同類型GST序列中均保守。PtGSTU1蛋白G-site活性位點13位的絲氨酸對GST蛋白活性至關重要[15-16]，位于α1螺旋末端，α1螺旋空間結構的改變將直接影響G位點與第一底物GSH的結合。

精氨酸為堿性氨基酸，其帶正電，具有-(CH2)3-NH-CNH-NH2的長側鏈，能在空間上最大限度接近位于C端α4螺旋上的103位天冬氨酸，與天冬氨酸側鏈上的-COOH形成N-H…O型氫鍵。將18位的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼釙r（R18K），雖然其側鏈具有4個碳原子長鏈，能夠接近C端結構域，但由于極性降低（R，pKa=12.0；K，pKa=10.5），影響了氫鍵形成。R18H突變體的18位精氨酸側鏈被組氨酸咪唑基取代，不僅極性降低（H，pKa=6.08），且側鏈長度變短。此外，當突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）和丙氨酸（A）時，側鏈上的氨基被甲基取代，同時影響了該位點的電負性和空間結構。突變?yōu)楣劝彼幔‥）時，側鏈為-CH2-CH2-COOH，該位點由堿性氨基酸變?yōu)閹ж撾姷乃嵝园被?，破壞氫鍵形成。當突變?yōu)樯彼幔╓）時，β-吲哚基增加了-N-H與103位天冬氨酸形成氫鍵的位阻。對突變體蛋白的表達分析顯示，無論將18位精氨酸突變?yōu)閴A性還是酸性氨基酸，均會影響蛋白的正確折疊，因此，所有R18突變體蛋白均表達為包涵體，盡管R18A在上清中檢測到微弱表達，其活性也遠低于野生型。這預示著在植物GST中，18位精氨酸可能是穩(wěn)定單體結構的關鍵氨基酸之一。

與在植物中極為保守的18位精氨酸相比，103位天冬氨酸僅在Tau類GST中保守。將天冬氨酸-CH2-COOH側鏈替換為-CH3時，雖然失去了強極性的氧原子，但依然能夠形成正確的蛋白折疊；但其底物活性相較于野生型明顯降低，對底物的親和力降低了將近1倍，催化效率降低近10倍，預示著這一位點的突變可能影響了活性位點的空間結構。同時，熱力學穩(wěn)定性檢測也驗證了，D103A突變體的穩(wěn)定性明顯低于野生型。說明，盡管103位天冬氨酸能夠參與形成氫鍵，但它的突變并不會使蛋白完全失活，而是明顯降低其的催化能力和穩(wěn)定性。這不僅印證了GST蛋白C端結構域的多變性，同時預示著C端結構域中可能存在其他氨基酸位點能夠與18位精氨酸形成氫鍵，從而穩(wěn)定蛋白單體折疊結構。

4 結論

本研究通過對油松PtGSTU1野生型和突變體的酶學功能檢測發(fā)現(xiàn)， N 末端 18 位精氨酸（Arg18）和 C 末端 103 位天冬氨酸（Asp103）形成的氫鍵對穩(wěn)定蛋白單體結構具有重要作用。由于植物中GST蛋白N端結構域具有保守性，C端結構域具有多變性，Arg18的突變對單體穩(wěn)定性的影響大于Asp103 ，表明C端結構域中可能存在其他氨基酸位點能夠與18位精氨酸形成氫鍵，從而穩(wěn)定蛋白空間結構。