孫海菁，施 翔，陳益泰，王樹鳳，徐琴娣

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省林木育種技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311400)

弗吉尼亞櫟（Quercus virginianaMill）原產(chǎn)美國，為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（QuercusL.）常綠高大喬木，分布于美國東南沿海。弗吉尼亞櫟是沿海森林植被群落中的優(yōu)勢樹種，其根系深而發(fā)達，具有很強的抗風(fēng)能力，能抵御颶風(fēng)和暴雨的襲擊，耐短期水澇；還耐干旱、高濃度鹽霧和土壤鹽分，病蟲害較少，是難得的沿海防護林優(yōu)良樹種[1-2]。又因其四季常青，樹冠開闊，也可作為良好的行道遮陰樹種和園林綠化樹種。

弗吉尼亞櫟于2001年首次引入我國，在浙江富陽、上虞、慈溪、海寧和上海、江蘇等地海涂試種，都表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性[3-4]。目前，國內(nèi)弗吉尼亞櫟苗木大多依靠種子繁殖，由于種子變異大[5]，實生苗在生長速度、株形、葉形等方面具有很大差異，導(dǎo)致苗木質(zhì)量參差不齊，嚴重制約生產(chǎn)推廣。同時，弗吉尼亞櫟種子沒有休眠期，只要條件合適即可萌發(fā)，不耐儲存，且存在象甲及動物取食的影響，種子產(chǎn)量極不穩(wěn)定。無性繁殖對控制弗吉尼亞櫟苗木質(zhì)量及苗木快繁具有重要意義。研究報道，弗吉尼亞櫟通過扦插繁殖，可達70%～80%的生根率[6-7]，但依然存在生根率不穩(wěn)定、難以規(guī)?；a(chǎn)等問題。因此，有必要進一步探索、完善弗吉尼亞櫟無性繁殖技術(shù)，尤其組織培養(yǎng)研究。

櫟類樹種組織培養(yǎng)研究始于20世紀80年代末，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，通過體細胞胚發(fā)生和芽再生的方法已實現(xiàn)多種櫟樹植株再生，培養(yǎng)成功的櫟樹已近30個種[8]，包括歐洲夏櫟（Q. roburL.）[9-10]、歐洲栓皮櫟（Q. suberL.）[11-12]、冬青櫟（Q. ilexL.）[13]、北美紅櫟（Q.rubraL.）[14]、麻櫟（Q.acutissimaCarruth.）[15]以及高山櫟（Q.semecarpifoliaSm.）[8]等。近年來，國內(nèi)在大葉櫟（Castanopsis fissa(Champ. ex Benth.) Rehd. et Wils.）[16]、遼東櫟（Q. liaotungensisKoidz.）[17]、蒙古櫟（Q. mongolicaFisch. ex Ledeb）[18]等櫟樹組織培養(yǎng)上也取得一些突破。弗吉尼亞櫟引種以來，國內(nèi)針對育苗技術(shù)、繁殖技術(shù)以及對生態(tài)因子的響應(yīng)等方面展開了大量研究[19-22]。培育弗吉尼亞櫟無性系苗是當(dāng)前該樹種生產(chǎn)過程中的一大難題，雖然已有試驗以扦插繁殖進行無性系選育[6-7]，但至今沒有應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中。本研究以弗吉尼亞櫟莖段為外植體，通過不定芽增殖途徑，探索弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)過程中外植體防褐化措施、不同種類激素及激素配比對不定芽增殖和生根的影響，以期建立弗吉尼亞櫟試管苗再生體系，為弗吉尼亞櫟無性系選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

弗吉尼亞櫟種子或帶芽莖段。種子來源于浙江上虞弗吉尼亞櫟母樹林，該母樹林位于紹興市上虞區(qū)瀝海鎮(zhèn)，營建于2004年，造林種源來自美國路易斯安那州。帶芽莖段取自中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所實驗大棚2～4年生地栽苗，取材一般在每年3—5月份，剪取未木質(zhì)化新萌枝條備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 種子或莖段經(jīng)自來水沖洗24 h后，再以75%的酒精消毒30 s（若是大田采取的外植體，加入1～2滴吐溫-80），在無菌操作臺以升汞浸泡3～10 min（其中幼嫩葉片或頂芽需3 min，種子需8 min），然后以無菌水沖洗3～5次，置于無菌玻璃瓶備用。

1.2.2 無菌苗培養(yǎng) 選取無蟲眼、顆粒飽滿的弗吉尼亞櫟種子，在自來水中浸泡24 h，棄去漂浮的種子，然后以飽和漂白粉上清液浸泡30 min進行表面消毒，消毒后的一部分種子剝?nèi)シN皮，于超凈工作臺內(nèi)，按1.2.1程序進行消毒，消毒后的種子接種于瓊脂培養(yǎng)基，置于（25±2）℃培養(yǎng)室內(nèi)進行暗培養(yǎng)。

1.2.3 外植體防褐化試驗 采用3種防褐化試劑[23-24]：抗壞血酸、硫代硫酸鈉和活性炭，質(zhì)量濃度分別為：抗壞血酸2.50、5.00 g·L-1，硫代硫酸鈉 1.00、2.00 g·L-1，活性炭 1.00、3.00、5.00 g·L-1，分別添加于增殖培養(yǎng)基中，對照培養(yǎng)基則不添加任何防褐化試劑。

1.2.4 不定芽增殖及壯苗試驗 2012—2017年間，以MS、1/4MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和吲哚乙酸（IAA）進行不定芽增殖試驗，6-BA 質(zhì)量濃度為 1.00、1.20、1.50 mg·L-1，NAA 為 0.00、 0.10、 0.20 mg·L-1， IAA 為 0.00、0.30、0.50 mg·L-1，設(shè)置細胞分裂素和生長激素不同濃度配比，以只添加細胞分裂素（6-BA）的培養(yǎng)基作為對照，激素濃度設(shè)置參考文獻[9-18]有關(guān)濃度配比及項目組前期的大量試驗。在無菌條件下，將滅菌的嫩枝剪成1 cm左右?guī)а壳o段，每種處理接種50個莖段，3次重復(fù)，分別在接種15、30 d后記錄莖段生長、增殖情況和不定芽健康狀態(tài)等，進行綜合評價。培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照3 000 lx，光暗周期14 h/10 h，培養(yǎng)室相對濕度70%左右。

1.2.5 生根培養(yǎng) 以1/4MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的吲哚丁酸（IBA）和NAA進行生根試驗，IBA質(zhì)量濃度為0.50、0.80、1.00 mg·L-1，NAA為0.50、1.00、1.50 mg·L-1，將壯苗培養(yǎng)中生長一致的苗接種于不同培養(yǎng)基，每個處理接種15株，3次重復(fù)，接種20 d后統(tǒng)計生根情況及根系狀態(tài)。

1.2.6 煉苗及移植 試管苗生根后，先將生根的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，置于馴化室中進行馴化，3～5 d后取出小苗，洗凈根部，移植于裝有滅菌河沙的無紡布容器袋，置于大棚內(nèi)培養(yǎng)，期間嚴格控制水分，保持沙子表面濕潤。30 d后統(tǒng)計幼苗成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑和吸附劑對外植體褐化的影響

由表1可以看出：3.00、5.00 g·L-1活性炭處理對防止弗吉尼亞櫟外植體褐化效果最好，但5.00 g·L-1的活性炭中芽生長的啟動時間延長，因此，在培養(yǎng)基中添加3.00 g·L-1的活性炭可有效防止褐化。另外，發(fā)現(xiàn)多次反復(fù)接種也可以有效防止褐化。外植體第一次接種后，培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基，如此轉(zhuǎn)接3次，褐化基本不會發(fā)生。

2.2 培養(yǎng)基成分和激素配比對不定芽增殖和生長的影響

試驗發(fā)現(xiàn)：在添加不同質(zhì)量濃度激素的MS、1/4MS和WPM培養(yǎng)基中，弗吉尼亞櫟莖段均能生長，但在MS培養(yǎng)基中，外植體褐化較嚴重，在低鹽的1/4MS和WPM培養(yǎng)基中，褐化較輕（表2）。

從表3可以看出：在供試的33種培養(yǎng)基中，5號、20號、21號培養(yǎng)基對弗吉尼亞櫟叢芽發(fā)生具有促進作用，特別是5號配方，莖段在該培養(yǎng)基中叢芽發(fā)生最多，增殖倍數(shù)達6.60，且叢芽生長狀態(tài)良好。21號培養(yǎng)基雖然增殖倍數(shù)也較高，但增殖的芽纖弱，且部分葉片沒有展開。

2.3 不同激素配比對弗吉尼亞櫟叢芽生根的影響

由表4可以看出：生根培養(yǎng)20 d 時，單獨添加IBA或NAA均導(dǎo)致弗吉尼亞櫟叢芽基部愈傷化，雖然部分叢芽也有根的發(fā)生，但生根率極低，最高也僅3.33%。在本試驗中，生根率最高的激素配比是 0.50 mg·L-1IBA+0.50 mg·L-1NAA，該培養(yǎng)基中叢芽的生根率可達53.33%，且每株芽的平均根數(shù)達到6條，同時在該培養(yǎng)基中發(fā)生的根系狀態(tài)也與其它不同，該培養(yǎng)基中的根較粗壯，且木質(zhì)化程度較高。另外，發(fā)現(xiàn)在IBA質(zhì)量濃度不變情況下，提高NAA質(zhì)量濃度不利于弗吉尼亞櫟的生根。

2.4 弗吉尼亞櫟試管苗的移植

對形成木質(zhì)化根的弗吉尼亞櫟試管苗進行煉苗移植。首先將培養(yǎng)容器蓋打開，放在培養(yǎng)室中進行3～5 d煉苗，然后將試管苗取出，以滅菌河沙為介質(zhì)進行移植，放于大棚中培養(yǎng)。2016—2018年，共計移苗61株，平均成活率57.78%，其中，2017年5月移植的試管苗成活率達83.33%以上。通過對試管苗移植的觀察，其成活率與葉片的數(shù)量和大小有關(guān)，葉片較多的試管苗更易成活，推測可能是由于葉片數(shù)量多，使光合產(chǎn)物增多，從而提高了試管苗的活力。

弗吉尼亞櫟試管苗移植的成功說明通過不定芽增殖途徑獲得試管苗的技術(shù)體系是可行的，因此，基于組織培養(yǎng)中外植體防褐化措施、不定芽增殖和叢芽生根等過程影響因子的選擇和優(yōu)化，建立弗吉尼亞櫟試管苗再生體系，具體流程見圖1。

表 1 不同濃度抗褐化劑對外植體褐化及芽啟動時間的影響Table 1 Effects of anti-browning agents with different concentration on browning of explants and the initial time for buds

表 2 弗吉尼亞櫟莖段在不同基本培養(yǎng)基的生長狀況Table 2 Growth difference of stem segments ofQ. virginiana on different primary media

3 討論

櫟類樹種是離體培養(yǎng)較難的樹種之一，影響其組織培養(yǎng)最重要原因之一是外植體的褐化[25]，褐化主要與植物組織內(nèi)的酚類物質(zhì)有關(guān)，木本植物由于本身含豐富木質(zhì)素、單寧、色素等次生代謝物，因此較草本植物更容易褐化[26]。研究表明，外植體的褐化與基因型、外植體取材部位、取材季節(jié)以及外植體本身的年齡等有關(guān)，一般而言，年齡越大，木質(zhì)化程度越高的外植體越容易褐化，幼齡組織褐化相對較輕[23]。然而，位于形態(tài)學(xué)最上端的頂端分生組織，由于細胞活躍，各種酶活性較高，作為外植體進行組織培養(yǎng)時，也很容易褐化。劉光金等[27]對3年生大葉櫟不同部位莖段進行多酚含量測定發(fā)現(xiàn)，半木質(zhì)化枝條莖段和葉子的多酚類物質(zhì)含量高于新生萌芽條的莖段與葉子，而同一枝條形態(tài)學(xué)上端多酚類物質(zhì)含量高于形態(tài)學(xué)下端。于艷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，采用麻櫟枝條的幼嫩莖段和半木質(zhì)化的莖段作為外植體，褐化率較低，萌發(fā)率較高；而采用帶生長點的莖尖作為外植體，褐化率最高。本研究也發(fā)現(xiàn)，從成年弗吉尼亞櫟植株上取材的外植體在培養(yǎng)過程中褐化較嚴重，而無菌苗取材的外植體基本未發(fā)現(xiàn)褐化現(xiàn)象。呂秀立等[28]在研究舒瑪櫟（Q. shumardiiBuckl.）組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，從自然條件下生長的枝條取材，無論是頂芽還是腋芽莖段，外植體褐化非常嚴重，均難以正常的生長。

表 3 不同激素種類、配比對弗吉尼亞櫟叢芽發(fā)生及生長的影響Table 3 Effects of different types and proportion of hormones combination on the development and growth of cluster buds of Q. virginana stem segments

表 4 不同激素配比對弗吉尼亞櫟叢芽生根的影響Table 4 Effects of different proportions of hormone combination on root development of cluster buds in Q. virginiana

組織培養(yǎng)中的防褐化措施，主要從培養(yǎng)基的選擇、pH值、硬度、外植體的選擇和處理以及吸附劑、抗氧化劑和激素的添加等方面抑制[23]，其中，向培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和活性炭是最常用的措施，且也是最有效的措施。劉光金等[27]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加活性炭、抗壞血酸可以有效減輕大葉櫟外植體的褐化。于艷等[24]發(fā)現(xiàn)，對麻櫟莖段褐化抑制效果最好的是1.0 mg·L-1PVP。在本研究中，針對野外取材的外植體，采用活性炭和添加抗氧化劑的方法對褐化進行控制試驗，發(fā)現(xiàn)活性炭和抗氧化劑對弗吉尼亞櫟外植體的褐化均有一定的抑制作用，但總的來說，活性炭的效果要優(yōu)于抗氧化劑。作者發(fā)現(xiàn)，弗吉尼亞櫟外植體切口處氧化速度非?？?，因此，在接種過程需要盡快將外植體接種到培養(yǎng)基中，而活性炭對已經(jīng)產(chǎn)生的酚類物質(zhì)具有很好的吸附作用，推測這可能是活性炭對弗吉尼亞櫟外植體更有效的原因?？寡趸瘎╇m然能夠抑制外植體進一步的氧化，但對已經(jīng)產(chǎn)生的酚類物質(zhì)無法去除，因此，導(dǎo)致接種前產(chǎn)生的酚類物質(zhì)在培養(yǎng)基中擴散。

6-BA在促進櫟樹不定芽增殖方面的效果已在眾多組織培養(yǎng)中得以證明，但不同櫟樹不定芽增殖階段對6-BA的濃度反應(yīng)均有不同。在歐洲夏櫟組織培養(yǎng)研究中，Chalupa[9,29]發(fā)現(xiàn)，0.88～3.50 μmol·L-16-BA在誘導(dǎo)不定芽增殖方面的效果要優(yōu)于6-糠氨基嘌呤（KT）。Puddephat等[10]認為，0.44 μmol·L-16-BA（約 0.10 mg·L-1）對夏櫟腋芽的誘導(dǎo)、伸長以及數(shù)量增殖均有良好的促進效果，而較高濃度 6-BA（4.40 μmol·L-1）則會導(dǎo)致玻璃化、基部愈傷化以及葉片的變形扭曲，進而影響芽的伸長生長。在北美紅櫟組織培養(yǎng)過程中，Vengadesan 等[14]發(fā) 現(xiàn) ， 4.40 μmol·L-1（ 約 1.00 mg·L-1）6-BA可以促進不定芽的增殖。蒙古櫟在含有 0.20 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)效果最佳[18]，而麻櫟不定芽的誘導(dǎo)則需要1.00 mg·L-16-BA[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，1.20 mg·L-16-BA對弗吉尼亞櫟不定芽的誘導(dǎo)效果最佳，增值倍數(shù)可達6.6。因此，作者推測在櫟類樹種不定芽誘導(dǎo)過程中，6-BA 濃度在 0.44～4.40 μmol·L-1范圍進行試驗設(shè)計，可以有效縮短試驗探索周期。在不定芽誘導(dǎo)和增殖方面，除6-BA單獨使用以外，6-BA常與GA、TDZ以及NAA組合使用，也能獲得良好的增殖系數(shù)[14]?？紤]到成本問題，作者在設(shè)計弗吉尼亞櫟不定芽增殖試驗中使用6-BA和NAA組合，但發(fā)現(xiàn)NAA在0.50～1.50 mg·L-1條件下，與不同濃度6-BA搭配，增值倍數(shù)最高也僅4.18，均不及單獨使用6-BA的效果，推測可能是NAA濃度過高，抑制了不定芽的增殖[31]。由于本試驗并未考慮6-BA與GA和TDZ的組合，因此，為提高弗吉尼亞櫟不定芽增殖系數(shù)，今后的研究中應(yīng)加以補充，以尋找最佳的激素組合。

圖 1 弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)流程Fig. 1 Different steps of tissue culture of Q. virginiana

試管苗的生根誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵步驟，在櫟樹生根誘導(dǎo)過程中，激素配比及其施用方法對根系的發(fā)生至關(guān)重要，其次，培養(yǎng)基組分、光暗周期等均可影響試管苗的生根。研究發(fā)現(xiàn)，在櫟樹試管苗生根誘導(dǎo)過程中，IBA的效果優(yōu)于NAA[11]，但也有采用IBA與NAA組合使用獲得良好的生根效果，Chalupa采用IBA（0.30 mg·L-1）和 NAA（0.10 mg·L-1）用于夏櫟（Q. roburL.）的誘導(dǎo)生根[9]。研究發(fā)現(xiàn)，IBA的濃度和施用方法均可影響根系的誘導(dǎo)，大多數(shù)研究是在含有激素的培養(yǎng)基中進行連續(xù)培養(yǎng)，IBA濃度最低為2.50 μmol·L-1，可用于舒瑪櫟的生根培養(yǎng)[32]；Manzanera等[11]采用5.00 mg·L-1IBA連續(xù)培養(yǎng)7～14 d，獲得栓皮櫟（Q. suberL.）的試管苗生根。當(dāng)采用高濃度IBA時，一般采用短期浸泡方式誘導(dǎo)生根，Purohit等采用 100.00 μmol·L-1IBA 對櫟樹不定芽基部進行24 h浸泡，Q. glaucaThunb、Q. leucotrichophoraL.和Q. floribundaLindl. 試管內(nèi)生根[33-35]。本研究在 IBA 0.50 mg·L-1和 NAA 0.50 mg·L-1條件下，獲得良好的生根率（53.33%），其次為IBA 0.50 mg·L-1和 NAA 1.50 mg·L-1，生根率 40.67%，但 NAA比例提高時，基部愈傷化明顯，根系不發(fā)達；而在IBA:NAA為1時，獲得的根系粗壯，木質(zhì)化程度高，移苗成活率也高。除此以外，研究也表明，低鹽基本培養(yǎng)基有利于櫟樹試管苗的生根[29,36]，不定芽誘導(dǎo)過程中采用WPM和1/4MS兩種低鹽培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)1/4MS對不定芽的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于WPM，因此，在生根誘導(dǎo)過程中采用1/4MS培養(yǎng)基，也獲得良好的生根誘導(dǎo)效果。

4 結(jié)論

研究表明，野外取材的弗吉尼亞櫟外植體易褐化，但可通過添加 3.00 g·L-1或 5.00 g·L-1的活性碳解決；無論是室內(nèi)無菌苗來源的外植體，還是野外取材，均可通過不定芽增殖途徑獲得大量的叢芽，進而獲得生根的試管苗。由于弗吉尼亞櫟喜砂質(zhì)土壤，因此，試管苗的移植開始宜采用滅菌河沙，在河沙中成活以后，可移植至含有營養(yǎng)基質(zhì)的土壤。