曾 圣， 劉 偉， 杜 強， 王艷艷， 周 洲， 胡世然

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心, 貴州 貴陽 550025； 3.黔東南州農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所， 貴州 凱里 556000)

鯉(Cyprinuscarpio)屬硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鯉亞科、鯉屬，在我國除西部高原外，各地淡水中均有分布，是養(yǎng)殖歷史悠久(2 400余年)的重要養(yǎng)殖魚類。我國幅員遼闊、水資源豐富，有多個地方鯉魚種群，如黃河鯉、鏡鯉、興國紅鯉等，因而我國是巨大的鯉魚種質(zhì)資源庫。近年來，通過雜交育種形成的福瑞鯉、松浦鏡鯉等高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益[1-3]。

清水江鯉是貴州省黔東南州、黔南州等地稻田主要養(yǎng)殖的魚類品種，具有較高的經(jīng)濟價值。由于梯級電站開發(fā)、增殖放流及人工養(yǎng)殖新品種的引入，野生清水江鯉的數(shù)量日趨減少，其種質(zhì)資源遺傳多樣性也受到了一定程度的破壞。

目前，對清水江鯉的研究相對較少，董在杰等[4]通過微衛(wèi)星標記和形態(tài)指標對清水江鯉的種質(zhì)資源現(xiàn)狀的研究結(jié)果表明，清水江鯉群體表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平，且群體內(nèi)存在顯著遺傳分化。周洲等[5]通過測定清水江鯉8個形態(tài)學(xué)指標，研究清水江鯉外部形態(tài)性狀對體質(zhì)量的影響表明，體長、體高、體厚、尾柄高、尾柄長是影響清水江鯉體質(zhì)量的主要性狀。胡世然等[6]研究了清水江鯉在池塘養(yǎng)殖條件下的適應(yīng)溫度范圍、最適攝食生長溫度、溶氧需求及pH適應(yīng)范圍等的結(jié)果表明，野生清水江鯉可經(jīng)人工馴化為淡水名優(yōu)養(yǎng)殖魚類。胡世然等[7]將清水江鯉與江西興國紅鯉進行雜交改良，清水江鯉雜交改良子一代稻田飼養(yǎng)增產(chǎn)效果顯著。

人工選育是開發(fā)和保護清水江鯉種質(zhì)資源的重要手段之一，為了解清水江鯉早期性腺發(fā)育及性腺發(fā)育過程中相關(guān)基因的表達，通過組織學(xué)切片觀察不同時期清水江鯉性腺，并通過RACE及RT-PCR克隆清水江鯉Foxl2基因，并分析Foxl2的功能，以期為清水江鯉的人工選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

清水江鯉苗種及成魚由凱里市福瑞水產(chǎn)養(yǎng)殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 性腺樣品采集及觀察 選取孵化后50 d、70 d、90 d、120 d、150 d和240 d清水江鯉性腺進行組織學(xué)切片觀察，以了解清水江鯉的性腺發(fā)育情況。清水江鯉性腺用波恩氏液固定過夜，70%酒精洗滌后，參照劉凱等[8]方法采用常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，運用浙江科迪KD2508輪轉(zhuǎn)式切片機進行連續(xù)切片，切片厚度為6 μm，H.E染色，中性樹膠封片，NIKON E50i顯微鏡下觀察并拍照，應(yīng)用Photoshop CS 6.0編輯圖片。

1.2.2 免疫組化 為觀察清水鯉早期生殖細胞分化情況，運用上述孵化后50 d及90 d切片進行免疫組化染色，抗體選用Vasa兔多克隆抗體(生殖細胞特異性抗體)。免疫組化主要參考DONG等[9]的方法。用0.01 M PBS洗滌3次，每次洗滌10 min后，將切片浸入含有0.1%吐溫20的0.01 M檸檬酸緩沖液(pH6.0)中煮5 min。用Vasa兔多克隆抗體(1∶1 000)在4℃下孵育過夜，用0.01 M PBS沖洗3次，每次沖洗5 min。隨后，將組織切片與二抗(羊抗兔IgG)和辣根過氧化物酶以1∶2 000比例孵育30 min，然后用PBS沖洗3次，每次沖洗5 min。以二氨基聯(lián)苯胺為底物，觀察免疫反應(yīng)信號。切片用蘇木精復(fù)染。

1.2.3Foxl2基因序列獲取 通過對項目組前期開展的清水江鯉成魚雌雄性腺轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(未發(fā)表)進行分析，獲取清水江鯉Foxl2基因中間序列，并通過5′-和3′-RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)及與鯉魚基因組序列比對獲取Foxl2基因全序列。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)生 進化樹包括人類(NP_075555.1)、小鼠(NP_036150.1)、雞(AEE80502.1)、斑胸草雀(XP_002187454.1)、非洲爪蛙(BAH22852.1)、施氏鱘(BAZ96608.1)、許氏平鲉(AEX58659.1)、牙鲆(BAF69017.1)、青鳉(NP_001098358.1)、尼羅羅非魚(NP_001266707.1)、紅鰭東方魨(XP_003968794.2)、半滑舌鰨(NP_001281128.1)、金錢魚(AGH32772.1)、尖吻鱸(XP_018539633)、斑馬魚(NP_001038717.1，NP_001304690.1)、稀有鮈鯽(ADN38241.1)、大口鲇(ABK76309.1)、斑點叉尾鮰(XP_017350481.1)、金魚(XP_026092361.1、XP_026055792.1和XP_026138658.1)、七彩神仙魚(AVP26899.1)、虹鱒(NP_001117956.1和NP_001117957.1)、大西洋鮭(XP_013992219.1)、日本鰻鱺(AXM42349.1和AXM42348.1)、黃鱔(AGM34484.1)、四川裂腹魚(ASU44863.1)、克氏原螯蝦(ALD48735.1)和居蟹皮海綿(CAE51212.1)的Foxl2氨基酸序列。

進化樹以NJ法采用MEGA 6.0[10-12]構(gòu)建。人類Foxl1(NP_005241.1)作為外類群。數(shù)值表示1 000次試驗所得到的步展值，代表每一分支的可信度。除清水江鯉Foxl2a與Foxl2b為試驗克隆外，其余Foxl2蛋白序列來源于NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫。

1.2.5Foxl2在清水江鯉成體組織中的表達 成體(24個月)清水江鯉麻醉后按性別解剖取其腦、垂體、鰓、心臟、脾臟、肝臟、腸、卵巢、精巢及腎臟液氮速凍，組織勻漿后按RNAiso Plus操作說明提取總RNA，提取的總RNA(約5.0 μg)用DNase I處理，以減少或避免基因組DNA的污染。取總RNA(約2.0 μg)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用基因特異引物進行擴增，檢驗Foxl2a和Foxl2b在各個組織中的分布情況。同時以鯉魚β-Actin引物擴增為內(nèi)參以驗證PCR過程中cDNA的質(zhì)量。PCR擴增參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃30 s，72℃60 s，循環(huán)28圈；72℃最終延伸10 min，4℃保存。所有PCR產(chǎn)物最后在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，并用SYBR Green I染色后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 清水江鯉性腺的早期發(fā)育

通過組織學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)，清水江鯉發(fā)育在孵化后50～90 d不能分辨性別(封2圖1a～c)，但能明顯分辨出生殖細胞，免疫組化(以Vasa為抗體)染色顯示生殖細胞為橢圓形，細胞核偏大(封2圖1a和c)；孵化后120 d的性腺出現(xiàn)初級精母細胞，初級精母細胞呈圓形小顆粒狀，胞質(zhì)弱嗜酸性(封2圖1d)；孵化后150 d的性腺出現(xiàn)初級卵母細胞，初級卵母細胞呈圓形，核膜的內(nèi)壁有核仁(封2圖1e)；孵化后240 d出現(xiàn)精細胞(封2圖1f)。

2.2 清水江鯉Foxl2序列比對及系統(tǒng)發(fā)生情況

基于RT-PCR、RACE和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，清水江鯉含有2個同源基因(Foxl2a和Foxl2b)， cDNA全長分別為1 057 bp和1 297 bp，完整ORF分別編碼307個和263個氨基酸。

通過對NCBI數(shù)據(jù)庫的搜索及比對，目前僅發(fā)現(xiàn)在硬骨魚類的斑馬魚、虹鱒、日本鰻鱺、金魚、斑點叉尾鮰、大西洋鮭及七彩神仙魚中存在Foxl2b，其中金魚存在2個Foxl2b(圖2)。

序列比對發(fā)現(xiàn)，清水江鯉Foxl2a與Foxl2b核苷酸序列相似性為50.16%，氨基酸序列相似性為44.01%。

通過氨基酸序列的比對，F(xiàn)oxl2a在硬骨魚類間有高度相似性，特別是中間區(qū)域Foxl家族含有的1個高度保守的約110個氨基酸的DNA-binding domain(DBD)(圖3)，氨基酸序列間的相似性為75.88%～99.02%。Foxl2b氨基酸序列僅在DBD區(qū)域相對保守(圖4)，其余區(qū)域相對不保守，氨基酸序列之間相似性為30.72%～90.08%。

2.3 Foxl2在清水江鯉成體組織中的表達

從圖5看出，清水江鯉Foxl2a僅在成體卵巢、腎臟及脾臟中表達，且在卵巢中的表達量高于脾臟和腎臟；Foxl2b僅在成體卵巢中表達。

注：B為腦，P為垂體，G為腮，H為心臟，S為脾臟，I為腸，L為肝臟，K為腎臟，T為精巢，O為卵巢，HK為頭腎。β-Actin為內(nèi)參。

Note: B, brain; P, pituitary; G, gill; H, heart; S, spleen; I, intestines; L, liver; K, kidney; T, testis; O, ovary; HK, head kidney.β-Actin, internal reference.

圖5清水江鯉成體組織中Foxl2a和Foxl2b的表達模式

Fig.5 Expression pattern ofFoxl2aandFoxl2bin adult tissues of QingshuijiangC.carpio

3 結(jié)論與討論

清水江鯉性腺發(fā)育至孵化后90 d時，通過免疫組化(以生殖細胞特異性表達的Vasa為抗體)可以看到性腺中存在大量生殖細胞，但通過HE染色仍不能明顯分辨性別，而黃河鯉在80 d時性腺已出現(xiàn)組織學(xué)上明顯的分化[13]。清水江鯉性腺發(fā)育明顯晚于黃河鯉性腺發(fā)育，可能是由于清水江鯉主要分布于貴州省黔東南州、黔南州等地區(qū)，海拔相對較高、氣溫相對較低所致。此結(jié)論將為清水江鯉人工繁殖及選育提供理論基礎(chǔ)。

研究獲得清水江鯉2個Foxl2的同源基因Foxl2a和Foxl2b，并通過系統(tǒng)發(fā)生驗證。

目前僅在硬骨魚類的斑馬魚、日本鰻鱺、金魚、虹鱒及鯉中發(fā)現(xiàn)2個(或以上)Foxl2旁系同源基因，其中金魚存在2個Foxl2b旁系同源基因，而在人類、小鼠、雞、斑胸草雀、非洲爪蛙等四足類中未發(fā)現(xiàn)2個(或以上)Foxl2旁系同源基因，表明，魚類基因組中存在的2個Foxl2旁系同源基因可能是由發(fā)生在輻鰭魚出現(xiàn)早期的額外的基因組復(fù)制(魚類特有的基因組復(fù)制，3R)產(chǎn)生[14-15]。金魚中存在2個Foxl2b基因可能與金魚與鯽魚共同祖先發(fā)生的特有基因組復(fù)制(4R)相關(guān)[16]。其他魚類僅存在1個Foxl2旁系同源基因可能是由于大部分魚類基因組測序尚未完成，還未發(fā)現(xiàn)其他的Foxl2旁系同源，也有可能是進化過程中全基因組復(fù)制往往伴隨著快速的基因丟失[17]所致。

氨基酸序列分析表明，硬骨魚類Foxl2a氨基酸序列相對保守，特別在中間及C末端區(qū)，其在不同物種中的功能也較相似；而Foxl2b相對不保守，其在不同物種中的功能可能會有所不同。

對哺乳動物的研究表明，F(xiàn)oxl2(與硬骨魚類Foxl2a同源)幾乎參與了卵巢發(fā)育和功能的所有階段及顆粒細胞相關(guān)的病理學(xué)。Foxl2通過與細胞DNA結(jié)合來打開或關(guān)閉某些基因，幫助顆粒細胞發(fā)育和功能[18-19]。在斑馬魚中的研究表明，F(xiàn)oxl2a和foxl2b協(xié)同調(diào)節(jié)斑馬魚卵巢的分化和維持，F(xiàn)oxl2b在阻止卵巢分化為睪丸方面起主導(dǎo)作用[20]。與其他脊椎動物(包括硬骨魚類)不同，三斑海豬魚Foxl2在自然改變性別的魚類中可能有不同的作用[21]。BARON等[22]發(fā)現(xiàn)，虹鱒Foxl2a和Foxl2b在卵巢中有特異表達，但表達的時間模式不同。Foxl2a的表達與芳香化酶的水平相關(guān)，雌激素處理遺傳雄性個體則會使Foxl2a與Foxl2b的表達上調(diào)。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)，清水江鯉Foxl2a和Foxl2b均在卵巢有較高表達，而在精巢沒有表達，這與Foxl2a和Foxl2b在虹鱒中的情況相似，表明Foxl2a與Foxl2b能在清水江鯉雌性性腺發(fā)育過程中起重要作用。清水江鯉Foxl2a和Foxl2b的具體功能，還有待進一步研究。