李玉霞，曲延英，艾海提·艾合買提，王慧敏，黃啟秀，陳琴，陳全家

（新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/ 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，烏魯木齊830052）

目前陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（G.barbadense）是生產(chǎn)上主要的兩大栽培種。 海島棉在纖維長度、斷裂比強度和細度等方面比陸地棉更優(yōu)異，而枯萎病也是海島棉生產(chǎn)中危害最為嚴重、造成經(jīng)濟損失最大的病害之一[1-2]。 棉花枯萎病菌 （Fusarium oxysporiumf.sp.vasinfectum） 是1 種尖孢鐮刀菌萎蔫專化型引起土壤維管束真菌病害[3]。 其主要防治措施有種植抗病品種、選購包衣棉種、適時播種與起壟種植、輪作換茬、清除病株與控制病情、增施有機肥和藥劑防治[4-6]， 但至今沒有能夠有效防治枯萎病的殺菌劑。 研究表明，植物在抵御病原危害過程中會啟動自身的防御體系，發(fā)展出基于病原的特異性免疫系統(tǒng)[7]。因而研究海島棉抗枯萎病分子機制，通過棉花功能基因組學分析來解析農(nóng)藝性狀調(diào)控的基因網(wǎng)絡[8-10]，進而培育出抗病抗逆高產(chǎn)高效優(yōu)質(zhì)的棉花新種質(zhì)，是防治枯萎病的1 種最經(jīng)濟有效的方法[11-12]。

在我國海島棉的主要生產(chǎn)區(qū)新疆南疆，近年來枯萎病危害日益加重，對海島棉產(chǎn)量和纖維品質(zhì)造成了很大影響，因而近幾年對于海島棉抗枯萎病的研究逐漸增多，也取得了初步進展。 本實驗室前期轉(zhuǎn)錄組測序和抗病表達譜數(shù)據(jù)篩選出來的類黃酮代謝途徑關鍵基因GbF3'H、GbCHI和GbDFR與抗病性有關。 研究表明， 類黃酮3'- 羥化酶（Flavonoid 3'-hydroxylase，F(xiàn)3'H）是細胞色素 P450 酶家族（Cytochrome P450，CYP450）的單加氧酶，在植物次生代謝和逆境調(diào)控方面起重要作用，它催化柚皮素和二氫山奈素的B 環(huán)3'位置羥基化，從而與柚皮素和二氫山奈素氧化形成的一系列類黃酮途徑中重要中間產(chǎn)物的結構穩(wěn)定性和抗氧化功能密切相關[13-14]。 前人的研究證實GbCHI基因是花色素苷合成途徑早期的關鍵酶之一，其表達效率直接影響植物花和果實的色澤和質(zhì)量[15-16]。 調(diào)控CHI基因的表達對于類黃酮合成有一定的影響[17]，誘導CHI基因表達能增加類黃酮的含量，相反抑制CHI基因的表達則會降低類黃酮含量，這在矮牽牛[18]、銀杏（Ginkgo bilobaL.）[19]和甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）[20]等植物中均得到證明。 二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）是植物花青素合成途徑中的關鍵酶，它在不同植株間具有高度的同源性[21]。有研究表明，DFR 功能的缺失會使植物的組織或器官的顏色變淺或者呈現(xiàn)無色。 所以，應用植物基因工程來改變植物組織或器官的顏色大多圍繞DFR 開展工作[22-25]。 根據(jù)植物中的類黃酮代謝途徑[26]，GbF3'H、GbCHI和GbDFR這 3 種基因之間的關系是：（1）GbCHI基因為GbDFR和GbF3'H的上游調(diào)控基因；（2） 同時GbCHI基因通過調(diào)控GbF3'H基因進而調(diào)控GbDFR基因；（3）GbF3'H基因也調(diào)控GbDFR基因。

由于 F3'H 催化生成的圣草酚（Eriodictyol）和二氫櫟皮黃酮（Dihydroquercetin）是花青素和原花青素生物合成的重要中間產(chǎn)物，目前對F3'H基因的研究主要集中在花青素代謝支路， 包括F3'H基因的表達量與植物不同器官顏色的相關性和F3'H基因?qū)ㄉ男揎?、對環(huán)境的應答、對逆境的抵抗等[27-31]，而對海島棉F3'H基因抗枯萎病性的研究尚且很少。 因此，本研究利用煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）載體構建病毒誘導的基因沉默 （Virus-induced gene silencing，VIGS）體系，在海島棉中有效沉默GbF3'H基因，并利用TRV 載體可以在同一棉株上對多個靶基因序列進行同時沉默的特性[32]，在同一株海島棉中同時沉默GbF3'H、GbCHI和GbDFR基因，研究GbF3'H基因單獨沉默， 以及GbF3'H、GbCHI和GbDFR這3 種基因共沉默對海島棉抗枯萎病性的影響，為后續(xù)研究海島棉基因的抗枯萎病功能、創(chuàng)制新的海島棉抗枯萎病種質(zhì)資源和進行海島棉功能基因組學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

海島棉抗病材料06-146，由新疆農(nóng)業(yè)大學作物遺傳育種實驗室保存。 病毒載體（pTRV1、pTRV2）及白化陽性對照載體（pTRV2-CLA1），由南京農(nóng)業(yè)大學郭旺珍教授贈予。 農(nóng)桿菌菌種（GV3101）和枯萎病菌（生理小種 7 號），由本實驗室保存。 DNA 瓊脂糖回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒是購自天根 （Tiangen） 生化科技有限公司。 pEASY-T1 Cloning Kit、TransStart Tip Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （RevertAid First strand cDNA Synthesis kit）、XbaⅠ酶、KpnⅠ酶、T4DNA 連接酶購于 Thermofish 公司，硫酸卡那霉素（Kanamycin）、慶大霉素硫酸鹽（Gentamycin sulfate）、嗎啉乙磺酸（2- (N-morpholino) ethane sulfonic acid，MES）、MgCl2、乙酰丁香酮（Acetosyringone）購自國內(nèi)生物公司。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基固體 / 液體：酵母提取物5 g （英國OXOID 公司）， 胰蛋白胨10 g（英國 OXOID 公司），氯化鈉 10 g，瓊脂粉（固體）15 g，用蒸餾水定容至1 L。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基固體 / 液體：馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉（固體）20 g，用蒸餾水定容至1 L。

1.2 VIGS目的片段的獲得及載體構建

以本實驗室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和熒光定量篩選為基礎[26]，利用轉(zhuǎn)錄組測序拼接得到的Unigene 序列，結合NCBI 數(shù)據(jù)庫中Blast 搜索結果，獲得類黃酮代謝途徑關鍵基因的編碼區(qū)，提取經(jīng)枯萎病菌處理后的海島棉06-146 下胚軸的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 為模板，通過聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）克隆海島棉類黃酮代謝途徑關鍵基因GbF3'H的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）序列，進行瓊脂糖凝膠純化回收， 回收產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用測序正確的GbF3'H基因大腸桿菌菌液提取質(zhì)粒，用于擴增構建VIGS 載體所需的片段。從海島棉GbF3'H基因的保守區(qū)域中選取帶特異位點的395 bp 核苷酸序列設計引物，并在引物的5'端分別加入限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ的酶切位點和保護堿基（表1），擴增海島棉GbF3'H基因ORF 上位于27～421 bp 的片段， 目標擴增片段長度為395 bp，送北京六合華大基因科技有限公司測序正確后，提取質(zhì)粒，用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳膠回收。 同時，用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切VIGS 病毒載體pTRV2質(zhì)粒，并進行膠回收。 上述雙酶切后的目的片段與載體使用T4DNA 連接酶進行連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，通過菌液PCR 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證獲得重組質(zhì)粒pTRV2-GbF3'H，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，擴大培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌液用于后續(xù)試驗。

1.3 棉花種植與培養(yǎng)

挑選飽滿脫絨種子，75%（體積分數(shù)）酒精消毒后，30%（體積分數(shù)）過氧化氫浸泡4～5 h，無菌水沖洗多次后浸泡30 h，將露白的種子播種于土壤中（黑土與蛭石體積比1∶1），置于人工氣候室培養(yǎng)（23 ℃恒溫，16 h 光照 /8 h 黑暗）。 每隔 5～6 d 澆一次水， 待棉苗2 片子葉平展開而真葉尚未伸出時，即可用于VIGS 操作。

1.4 農(nóng)桿菌介導的VIGS方法

在100 mL LB 液體培養(yǎng)基中加入50 mg·L－1卡那霉素、50 mg·L－1慶大霉素、10 mmol·L－1MES、20 μmol·L－1乙酰丁香酮，然后接入 1%（體積分數(shù)）攜帶有目的片段的沉默載體菌液，28 ℃、220 r·min－1培養(yǎng)至OD600為 1.2～1.5。 離心收集菌體細胞懸浮于 VIGS 重懸液中（10 mmol·L－1MgCl2，10 mmol·L－1MES，200 μmol·L－1乙酰丁香酮）， 調(diào)節(jié)侵染液最終濃度至OD600為1.5 左右，黑暗中靜置3～4 h。

設置以下處理：陰性對照（TRV::00）、陽性對照（白化表型）、GbF3'H基因單獨沉默處理（記為“F3'H”）和 3 種基因（GbF3'H、GbCHI、GbDFR）共沉默處理（記為“共沉默”）。 前3 個處理方法是將pTRV1分 別 與 pTRV2、pTRV2-CLA1 、TRV2-GbF3'H 的農(nóng)桿菌重懸液以1∶1 比例混合后注射棉花子葉；3 種基因共沉默處理方法是將pTRV1與 pTRV2-GbF3'H、pTRV2-GbCHI、pTRV2-GbDFR按3∶1∶1∶1 混合后注射棉花子葉。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

接種操作：每個處理50 株，3 個重復，采用注射器針頭刺破法，造成微創(chuàng)傷口，刺破不刺穿子葉背面， 用無針頭的注射器從傷口打入侵染液，暗處理1 d 后，置于上述人工氣候室培養(yǎng)。

1.5 沉默效率的檢測

棉株注射病毒15 d 后，觀察pTRV2-CLA1 幼苗真葉的顏色變化， 并分別采取空載體對照組、單基因沉默組、共沉默組棉株的根、莖和葉，每組3 株組成混池。 混池分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。 利用美國 ABI 公司 7500 Fast System熒光定量PCR 儀，以棉花GhUBQ7 為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量qRT-PCR 檢測沉默后目的基因的表達，所用引物見表 1。用 2－△△CT法計算各基因的相對表達水平。

1.6 棉花枯萎病菌生理小種7號接種及抗性鑒定

枯萎病菌菌株接種于PDA 固體培養(yǎng)基表面，23～25 ℃培養(yǎng) 2 周， 轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基以60 r·min－1振蕩培養(yǎng) 7～9 d，4 層紗布過濾，調(diào)節(jié)至孢子含量2×107mL－1，現(xiàn)配現(xiàn)用。

在侵染野生型（Wild type，WT）、空載體對照組（TRV::00）、GbF3'H單基因沉默組和 3 種基因共沉默組15 d 后， 進行枯萎病菌接菌處理，25 d后觀察并統(tǒng)計發(fā)病情況， 每個處理50 株，3 個重復，每株選取3～4 片葉，每個處理共選取500 片葉。 采用0～4 級方法統(tǒng)計病情指數(shù)[33]。

1.7 統(tǒng)計分析

用IBM SPSS Statistics 21 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 海島棉GbF3'H基因用于VIGS目的片段的克隆及沉默載體構建

提取經(jīng)枯萎病菌處理后的海島棉06-146 下胚軸的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 為模板，擴增獲得構建VIGS 載體所用的GbF3'H基因395 bp 的目的片段（圖1 A）。 沉默載體構建好后，提取質(zhì)粒，用XbaI 和KpnI 雙酶切進行驗證。 酶切片段大小與克隆片段一致， 證明pTRV2-GbF3'H 載體構建成功（圖1 B）。 將正確的 pTRV2-GbF3'H 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101 中， 用TRV2通用引物進行菌液PCR 檢測，以及用TRV2通用引物對空載體進行菌液PCR 檢測（圖1 C），正確的陽性克隆用于后續(xù)的侵染， 測序證明重組載體pTRV2-GbF3'H 構建正確（圖1 D）。

圖1 GbF3'H 基因沉默序列的克隆及VIGS 載體構建Fig.1 Cloning of GbF3'H gene silencing sequence and construction of VIGS vector

2.2 棉花TRV-VIGS體系的建立

注射TRV::00 的棉花葉片未呈現(xiàn)白化，表型與野生型無異。 而注射pTRV2-CLA1（陽性對照）的植株，棉花中葉綠素合成相關基因GhCLA1 表達被沉默，棉花的葉綠素合成受到干擾，新出現(xiàn)的真葉表現(xiàn)為葉脈及邊緣白化，逐漸擴散到整個葉片，從第2 片真葉起，表型明顯，嫩葉的白化比老葉更明顯，新生葉幾乎完全白化（圖2 A），而且基因沉默后海島棉植株的葉片變小， 株型緊湊，子葉以上的莖變?yōu)榘咨?統(tǒng)計表明， 注射pTRV2-CLA1 的 96 株海島棉全部白化。 沉默GbF3'H基因的 150 株海島棉， 及GbF3'H、GbDFR和GbCHI基因共沉默的150 株海島棉，都比野生型海島棉的株型緊湊，葉片變小（圖2 B）。表明本研究所用的VIGS 技術體系對目的基因沉默效果顯著。

2.3 目的基因的沉默效率

圖2 利用VIGS 沉默目的基因后的海島棉植株表型Fig.2 Phenotype of G.barbadense plants after silencing the target genes using VIGS

圖3 GbF3'H 基因沉默后其在海島棉根、莖和葉中的表達量Fig.3 Expression of the GbF3'H gene in roots, stems and leaves of G.barbadense after VIGS

注射 TRV::F3'H 載體后，GbF3'H基因在海島棉根、莖和葉中都有沉默表現(xiàn)， 沉默效果是葉＞根＞莖，其中在根和葉中與TRV::00 處理比較， 差異達到極顯著水平， 而在莖中與TRV::00處理比較沒有顯著性差異 （圖3）。 TRV::F3'H、TRV::CHI 和 TRV::DFR 共侵染的海島棉中GbF3'H、GbCHI和GbDFR基因在根、莖和葉中的表達量均比 TRV::00 處理低。 其中：GbF3'H基因在海島棉中的沉默效果是葉＞根＞莖， 且在根、莖和葉中的表達量與TRV::00 處理比較，均差異達到極顯著水平；GbCHI基因在海島棉中的沉默效果是葉＞莖＞根， 且在葉中的表達量與TRV::00 處理比較，差異達到顯著水平，在根和莖中與TRV::00 處理比較， 沒有顯著性差異；GbDFR基因在海島棉中的沉默效果是葉＞根＞莖，且在莖和葉中的表達量與TRV::00 處理比較，分別達到差異極顯著水平和顯著水平， 在根中與TRV::00 處理沒有顯著性差異（圖4）。 單獨沉默處理和3 種基因共沉默處理的GbF3'H基因在海島棉根、莖和葉的表達趨勢一致。

2.4 沉默基因棉株對枯萎病抗性鑒定結果分析

抗病性鑒定結果（圖5）顯示，接種枯萎病菌后25 d 時， 不同處理病情指數(shù)大小分別為WT（15.75）＜TRV::00（15.9）＜F3'H（29.5）＜共沉默（39.9）， 即注射基因沉默的棉苗發(fā)病比空載體對照棉苗嚴重，3 種基因共沉默處理比單獨沉默GbF3'H基因處理病情更嚴重，病情指數(shù)更高。 說明這3 種基因?qū)μ岣吆u棉總體抗性的作用要大于GbF3'H單個基因。

圖4 共沉默后GbF3'H、GbCHI 和GbDFR 基因在海島棉根、莖和葉中的表達量Fig.4 Expression of the GbF3'H, GbCHI and GbDFR genes in roots, stems and leaves of G.barbadense after co-silencing

圖5 海島棉基因沉默植株接種枯萎病菌后25 d 時的病情指數(shù)分析Fig.5 Analysis of disease index at 25th day after inoculation with Fusarium wilt for the gene silencing G.barbadense plants

3 討論

海島棉中GbF3'H基因?qū)儆赑450 家族。P450家族是超基因家族，按功能主要分為參與生物合成和生物解毒兩大類[34]。GbF3'H基因不僅是類黃酮代謝途徑中的關鍵基因，還在花色和果實的著色，以及逆境調(diào)控方面起重要作用。 關于類黃酮代謝途徑相關基因與植物抗病性的關系前人也做過研究，但主要集中在陸地棉中。 目前關于海島棉GbF3'H基因應對非生物脅迫的研究取得一定進展，但是其作用機制研究還比較少。

本試驗在前期轉(zhuǎn)錄組測序的基礎上分析出類黃酮代謝途徑與海島棉抗病有關，對類黃酮代謝途徑相關基因進行克隆，并利用病毒介導的基因沉默方法，沉默所研究的基因。 本研究和前人利用VIGS 方法研究基因功能的不同點是： 本研究在同一株海島棉中同時沉默GbF3'H、GbCHI和GbDFR這3 種基因，將基因沉默所需的時間、人力和物力最小化， 對功能基因組研究非常有利[32]。 對沉默基因棉株進行枯萎病菌接菌處理，病情指數(shù)大小分別為 WT （15.75）＜TRV::00（15.9）＜F3'H（29.5）＜共沉默（39.9），即基因沉默的棉苗發(fā)病比空載體對照棉苗嚴重，3 種基因共沉默處理比單獨沉默GbF3'H基因處理病情更嚴重。 說明這3 種基因?qū)μ岣吆u棉總體抗性的作用要大于單基因GbF3'H。 本研究進一步證實類黃酮代謝途徑對海島棉抵抗枯萎病起積極作用。但抗病基因在棉花中是如何調(diào)控棉花激活免疫反應提高抗病性還有待深入研究。

目前，海島棉中存在大量尚未發(fā)現(xiàn)的抗病相關基因。VIGS 可用于瞬時下調(diào)基因表達，用于確定基因?qū)μ囟ū硇偷挠绊憽?這對于候選基因確定和選擇具有控制病害潛力的基因尤其有用[35]。隨著VIGS 病毒載體的不斷開發(fā)，VIGS 體系已經(jīng)應用于不同植物，尤其是用常規(guī)方法難以進行基因功能研究的，例如櫻桃果實品質(zhì)基因功能的研究[36]。因此，利用VIGS 方法，挖掘棉花中抗旱、耐鹽、改良纖維品質(zhì)、抗病相關等特異功能基因顯得尤為重要。

4 結論

利用VIGS 技術， 初步確定GbF3'H基因與海島棉對枯萎病的抗性有關， 且可與GbCHI、GbDFR基因協(xié)同作用增強抗病性， 可為今后海島棉功能基因組學研究提供參考。