劉曉妍，馮 雪，朱銳銳，亐開興，魏雪鋒，馬 云,3，黃潔萍*

（1.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南信陽 464000；2.云南省草地動物科學(xué)研究院，云南昆明 650212；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750000）

脂肪分布于哺乳動物身體各處，按沉積部位可分為皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪和肌內(nèi)脂肪。不同部位的脂肪沉積存在差異，特別是肌內(nèi)脂肪，受遺傳（品種）、營養(yǎng)和飼養(yǎng)管理等因素影響[1-2]。按功能可將脂肪組織分為白色脂肪（White Adipose Tissue，WAT）、米色脂肪和棕色脂肪（Brown Adipose Tissue，BAT）[3]。其中，WAT 主要用于存儲多余的能量，BAT 可燃燒脂肪產(chǎn)生熱能，米色脂肪為由WAT 棕色化得到，功能與BAT 類似。在人和小鼠中，BAT、米色脂肪可用于抵御肥胖[4-7]；在新生家畜中，BAT 與米色脂肪燃燒產(chǎn)熱與新生個體存活率相關(guān)[8-12]；而在成年家畜中，BAT、米色脂肪燃燒產(chǎn)熱即為能量損失，對其育肥不利[13-14]。另外，BAT、米色脂肪與家畜耐寒性能相關(guān)[15-16]。人們普遍認(rèn)為黃牛比水牛耐寒[17]，但目前缺乏分子層面的證據(jù)。我國水牛歷史上以役用為主，脂肪沉積較黃牛差[18]，這是由遺傳因素或是飼養(yǎng)管理因素決定的，目前還缺乏相關(guān)報道。

本研究通過比較3 類脂肪標(biāo)志基因（BAT 標(biāo)志基因ZIC1、米色脂肪標(biāo)志基因UCP1、WAT 標(biāo)志基因LEP）在育肥水牛、育肥黃牛和未育肥水牛之間的表達模式，評估水牛和黃牛脂肪沉積的差異、WAT 棕色化水平的差異以及育肥因素對水牛不同部位脂肪沉積的影響。本研究將增加對水牛和黃牛不同部位脂肪組織特征的認(rèn)識，提供水牛與黃牛在耐寒性上存在差異的分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與樣品采集 實驗動物分為3 組，即育肥黃牛、育肥水牛、未育肥水牛，每組3 頭牛。育肥黃牛為36 月齡的夏南牛（公牛），來自于河南泌陽夏南牛場；育肥水牛和未育肥水牛為36 月齡的檳榔江水牛（公牛），來自于云南騰沖檳榔江水牛育肥場。24 月齡前，所有牛均按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)管理規(guī)范進行飼養(yǎng)；24 月齡開始進行為期一年的育肥，按標(biāo)準(zhǔn)飼喂精料，粗飼料和水自由采食；未育肥水牛組不飼喂精飼料，但粗飼料和水自由采食。36 月齡進行屠宰，屠宰后盡快采集背最長肌、背部皮下脂肪和腎周脂肪組織。采集的樣品迅速標(biāo)記好投入液氮中，帶回實驗室，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍ涝讜r，育肥黃牛和育肥水牛均具有明顯的皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪沉積，未育肥水牛皮下脂肪沉積很少，其內(nèi)臟脂肪沉積量也明顯少于育肥組（脂肪含量未進行具體測量）。育肥黃牛、育肥水牛、未育肥水牛屠宰時的平均體重分別為（541.3±49.36）kg、（552.2±54.8）kg、（505.8±36.13）kg。

1.2 總 RNA 提取和 cDNA 合成 利用 TRIzol 法進行總RNA 的提取，核酸濃度檢測儀測定總RNA 的濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的完整性。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）進行cDNA 的合成。

1.3 引物合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中水牛和黃牛的基因序列，用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Pick Primer 功能（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/），將引物設(shè)計在水牛和黃牛的保守區(qū)域。引物（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 實時定量PCR 檢測 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測使用FS Essential DNA Green Master（Roche）。參照說明書，使用10 μL 反應(yīng)體系：上下游引物各0.15 μL，Taq Polymerase 5.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.7 μL。反應(yīng)程序如下：首先95℃預(yù)熱600 s；然后進行擴增，擴增包括 95℃預(yù)熱10 s、60℃退火10 s、72℃延伸15 s三步，設(shè)45 個循環(huán)；最后測定熔解曲線，包括95℃預(yù)熱10 s、60℃退火60 s、97℃反應(yīng)1 s。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。以β-actin基因作為內(nèi)參，基因相對表達量用2-△△Ct法進行計算。

表1 qRT-PCR 使用到的引物信息

1.5 統(tǒng)計分析 基因相對表達量使用Excel 進行計算，利用SPSS 18.0 單因素方差分析法進行差異顯著性分析，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Origin85 軟件作圖。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 棕色脂肪標(biāo)志基因ZIC1在水牛和黃牛肌肉和脂肪組織間的表達模式分析 如圖1 所示，育肥水牛、育肥黃牛和未育肥水牛的ZIC1基因在肌肉和脂肪組織中的表達模式基本一致，即ZIC1基因主要在肌肉中表達；在水牛中，僅育肥水牛的皮下脂肪有一定量表達，其他脂肪組織幾乎不表達。如圖2 所示，ZIC1基因在育肥水牛肌肉組織中的表達量顯著高于育肥黃牛，在育肥水牛皮下脂肪組織的表達量顯著高于育肥黃牛和未育肥水牛。

2.2 米色脂肪標(biāo)志基因UCP1在水牛和黃牛肌肉和脂肪組織間的表達模式比較 如圖3 所示，UCP1基因在水牛和黃牛的肌肉和脂肪組織中均能檢測到；在育肥黃牛中，UCP1基因在肌肉、皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪間的表達量無顯著差異；在育肥水牛中，UCP1基因在內(nèi)臟脂肪中的表達量最高（P＜0.01），其次是皮脂，肌肉中表達量最低；在未育肥水牛中，UCP1基因在內(nèi)臟脂肪的表達量高于皮下脂肪（P＜0.05）和肌肉組織（P＜0.01）。由圖4 可知，UCP1基因在3 組牛肌肉組織中的表達量無顯著差異，在育肥水牛皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪中的表達量均顯著高于育肥黃牛和未育肥水牛。

圖1 ZIC1 基因在水牛和黃牛肌肉和脂肪組織中的mRNA 表達模式

圖2 水牛和黃牛肌肉和脂肪組織中ZIC1 基因mRNA 的表達水平

圖3 UCP1 基因mRNA 在水牛和黃牛肌肉和脂肪組織中的表達模式

圖4 水牛和黃牛肌肉和脂肪組織中UCP1 基因mRNA 的表達水平

圖5 LEP 基因mRNA 在水牛和黃牛肌肉和脂肪組織中的表達模式

圖6 水牛和黃牛肌肉和脂肪組織中LEP 基因mRNA 的表達水平

2.3 白色脂肪標(biāo)志基因LEP在水牛和黃牛肌肉和脂肪組織間的表達模式分析 如圖5 所示，水牛和黃牛的LEP基因主要在脂肪組織中表達；育肥水牛和育肥黃牛的LEP基因在皮下脂肪組織中的表達量最高，其次是內(nèi)臟脂肪，肌肉中表達量最低；而在未育肥水牛中，LEP基因在內(nèi)臟組織中的表達量最高，其次是皮下脂肪，在肌肉中表達量最低。如圖6 所示，在肌肉組織中，LEP基因在育肥黃牛中的表達量顯著高于育肥水牛和未育肥水牛；在皮下脂肪組織中，LEP基因在育肥黃牛中表達量最高，其次是育肥水牛，未育肥水牛最低，三者間差異極顯著；在內(nèi)臟脂肪中，LEP基因在育肥水牛中表達量最高，其次是育肥黃牛，未育肥水牛中表達量最低。

3 討 論

在成年人和小鼠上均已發(fā)現(xiàn)BAT 庫[5,19]，但在成年家畜身上未發(fā)現(xiàn)典型的BAT 庫。已有研究表明，成年水牛和黃牛的脂肪組織均為WAT，但存在異質(zhì)性，以白色脂肪細(xì)胞為主，同時存在少量的米色脂肪細(xì)胞或棕色脂肪細(xì)胞[13-14]。

在人和模式動物上的研究已揭示一批BAT 標(biāo)志基因，如UCP1、ZIC1、PRDM16 等[5-7]。與其他標(biāo)志基因相比，ZIC1基因更加特異地表達于BAT 中[5]。因而本研究選擇ZIC1基因作為BAT 標(biāo)志基因。有趣的是，ZIC1基因還是一個肌細(xì)胞發(fā)育重要調(diào)控基因，在肌肉組織中高表達[20-21]。本研究中，ZIC1基因主要在肌肉組織中表達，與其調(diào)控肌肉發(fā)育的功能相對應(yīng)[20-21]。本實驗結(jié)果顯示，在肌肉組織中，水牛的ZIC1基因表達量高于黃牛，提示ZIC1基因在水牛肌肉組織較黃牛活躍，這可能與水牛肌纖維較黃牛粗相關(guān)[18]。在脂肪組織中，ZIC1基因在皮下脂肪中有少量表達，在內(nèi)臟脂肪中幾乎不表達，提示育肥水牛和育肥黃牛皮下脂肪中可能存在少量的棕色脂肪細(xì)胞，這與Komolka 等[14]在黃牛上的研究結(jié)果一致。Komolka 等[14]對育肥黃牛進行研究發(fā)現(xiàn)，棕色脂肪細(xì)胞存在于皮下脂肪組織和肌肉相關(guān)的脂肪組織中，不存在于內(nèi)臟脂肪中，且不同品種的黃牛皮下脂肪組織ZIC1基因表達水平無差異。然而，在本研究中，ZIC1基因在育肥水牛皮下脂肪組織表達水平高于育肥黃牛，提示育肥水牛皮下脂肪組織中存在更豐富的棕色脂肪細(xì)胞；育肥水牛皮下脂肪中ZIC1基因表達量顯著高于未育肥水牛，提示育肥可能促進水牛皮下脂肪組織中棕色脂肪細(xì)胞的發(fā)育。

UCP1 是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，可將質(zhì)子從膜間轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)中，實現(xiàn)將能量從ATP 合成轉(zhuǎn)移到棕色脂肪細(xì)胞線粒體的熱生成中[22]。最初，UCP1基因被認(rèn)為是特異表達于BAT 中。后來發(fā)現(xiàn)一類新的脂肪細(xì)胞—米色脂肪細(xì)胞中也存在較高水平的UCP1基因的表達[23-24]。目前認(rèn)為，米色脂肪細(xì)胞由白色脂肪細(xì)胞棕色化得到[25-26]，UCP1基因在WAT 中表達提示米色脂肪細(xì)胞的存在。本研究中，UCP1基因在育肥水牛和育肥黃牛脂肪組織中表達，提示育肥水牛和育肥黃牛脂肪組織中存在WAT 棕色化的現(xiàn)象，這與前人研究結(jié)果一致[13-14]。本實驗結(jié)果表明，UCP1基因在水牛內(nèi)臟脂肪中的表達量顯著高于皮下脂肪，提示水牛的內(nèi)臟脂肪棕色化水平較皮下脂肪高；而在黃牛中，皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪間無顯著差異；另外，無論是在皮下脂肪還是在內(nèi)臟脂肪中，育肥水牛WAT 棕色化水平均顯著高于未育肥水牛，說明育肥可誘導(dǎo)水牛皮下和內(nèi)臟WAT 棕色化。Asano 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，育肥可誘導(dǎo)黃牛皮下脂肪中UCP1的表達，與本實驗中水牛結(jié)果一致，但其發(fā)現(xiàn)育肥對內(nèi)臟脂肪中UCP1的表達無顯著影響[13]，與本研究在水牛上的結(jié)果不同。UCP1 的出現(xiàn)提示W(wǎng)AT 棕色化，即出現(xiàn)了米色脂肪細(xì)胞。白色脂肪細(xì)胞負(fù)責(zé)存儲脂肪，米色脂肪或棕色脂肪細(xì)胞負(fù)責(zé)燃燒脂肪產(chǎn)生熱量[3]。本實驗中，育肥誘導(dǎo)的水牛皮下和內(nèi)臟WAT 棕色化水平均高于黃牛，提示水牛在耐寒方面可能優(yōu)于黃牛。這與目前認(rèn)為的黃牛較水牛更耐寒的觀點相矛盾[17]。目前黃牛比水牛耐寒的觀點主要基于它們在地理分布上的差別。從地理分布上看，黃牛主要分布于緯度較高的地區(qū)，如我國北方和歐洲各國；而水牛主要分布于低緯度地區(qū)，如我國南方和東南亞部分國家。有考古研究證明，歷史上我國北方也有水牛的存在[27]。至于后來為何水牛只分布于南方（主要為稻田區(qū)）還沒有一個明確的說法。因此，水牛和黃牛究竟誰更耐寒，仍需要進一步分子方面研究理論的支持。

瘦素基因（LEPtin，LEP）又稱肥胖基因，是脂肪沉積重要調(diào)控因子，其表達具有脂肪組織特異性。LEP被認(rèn)為是WAT 標(biāo)志基因，在WAT 中高表達，但在BAT 中也有少量表達[6,28]。本研究中，LEP基因主要在脂肪組織中表達，且在育肥水牛和育肥黃牛中，皮下脂肪的表達量均高于內(nèi)臟脂肪，這與前人研究結(jié)果一致[29]。在未育肥水牛上，趨勢則相反，提示育肥可誘導(dǎo)水牛皮下脂肪組織中LEP基因的表達。在肌肉組織中，LEP基因在育肥黃牛中的表達量高于育肥水牛，提示育肥后黃牛肌內(nèi)脂肪水平高于水牛，黃牛肌內(nèi)脂肪沉積能力優(yōu)于水牛，這與前人研究結(jié)果[18]一致；而育肥水牛和未育肥的水牛之間無明顯差異，提示育肥可能對水牛肌內(nèi)脂肪沉積無顯著影響。在皮下脂肪組織中，LEP基因在育肥黃牛中表達量顯著高于育肥的水牛，提示育肥可能對黃牛皮下脂肪沉積效果更佳；同時，育肥可使水牛皮下脂肪表達量顯著高于未育肥的水牛，說明育肥可顯著誘導(dǎo)水牛皮下脂肪的沉積；在內(nèi)臟脂肪中，育肥水牛LEP基因的表達量顯著高于育肥黃牛和未育肥水牛。這些研究結(jié)果提示，育肥后黃牛的脂肪可能更容易沉積于皮下和肌內(nèi)，而水牛的脂肪則可能更傾向于沉積在內(nèi)臟周圍。當(dāng)然，這些仍需要相關(guān)屠宰測量數(shù)據(jù)的支持。

4 結(jié) 論

本研究獲得了棕色脂肪標(biāo)志基因ZIC1、米色脂肪標(biāo)志基因UCP1和白色脂肪標(biāo)志基因LEP在育肥水牛、育肥黃牛以及未育肥水牛的肌肉和脂肪組織中的表達模式，研究結(jié)果進一步支持育肥牛皮下脂肪組織中存在少量棕色脂肪細(xì)胞、皮下和內(nèi)臟脂肪組織均存在白色脂肪細(xì)胞棕色化的觀點，初步揭示育肥水牛脂肪組織中，白色脂肪細(xì)胞棕色化水平高于育肥黃牛，水?？赡鼙赛S牛更具抗寒潛力，黃牛肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪沉積能力可能高于水牛。