張 江，李火明，蔡文通，周曉容

（1.安杰利（重慶）生物科技有限公司，重慶402460；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶402460）

在飼料中應(yīng)用抗生素可明顯提高動物生長性能、降低死亡率，提高生產(chǎn)效益，但也存在一定弊端和潛在危害，如降低動物免疫力、增加細(xì)菌耐藥性以及影響食品安全。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號，自2020 年1 月1日起，除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑禁止使用，標(biāo)志著飼用抗生素作為促生長劑將停止在飼料中使用，因此抗菌肽、微生物制劑、植物提取物以及酸化劑等抗生素替代品逐漸受到關(guān)注而成為研究熱點(diǎn)。抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMP）是生物體產(chǎn)生的一種與宿主防御相關(guān)的具有先天性免疫作用的小分子活性多肽?？咕牡闹饕饔脵C(jī)理是破壞微生物的細(xì)胞膜而使細(xì)菌裂解死亡，其抑菌殺菌機(jī)理區(qū)別于傳統(tǒng)的抗生素，故不易產(chǎn)生耐藥性[1-2]。大量試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，抗菌肽（如腸桿菌肽、天蠶素等）可替代抗生素在畜禽飼料上使用，能明顯降低動物腹瀉和提高生產(chǎn)性能[3-5]。桿菌七肽（又名腺苷七肽，Microcin 七肽）是20 世紀(jì)90 年末發(fā)現(xiàn)的腸桿菌屬（Enterobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等微生物分泌的小分子抗菌肽，其能抑制多種微生物，包括大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）等革蘭氏陰性細(xì)菌和部分革蘭氏陽性細(xì)菌[6-7]。桿菌七肽包含7 個氨基酸殘基（序列為MATGNAD），其C 端氨基酸殘基的羧基與單磷酸腺苷（AMP）的磷酸鍵通過共價鍵結(jié)合形成核酸肽；其主要通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和干擾微生物蛋白翻譯過程實(shí)現(xiàn)抑菌作用[8-9]。桿菌七肽可以通過微生物發(fā)酵和化學(xué)合成法生成，是一種潛在的抗生素替代品，但在國內(nèi)產(chǎn)業(yè)化研究剛起步[10]。本研究采用不同動物來源的病原菌和益生菌作為指示菌，研究桿菌七肽的抗菌譜以及溶血性，為飼用抗生素替代品的研發(fā)和體外評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌制劑與樣品 各菌株、來源及培養(yǎng)條件見表1。桿菌七肽產(chǎn)品中桿菌七肽含量為10%，載體為玉米芯粉和麥芽糊精，由安杰利（重慶）生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 MH（A）、MH（B）、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、MRS 肉湯、MRS 瓊脂、BHI、BHI（A）、TCBS 瓊脂、YPD、TSA 等微生物培養(yǎng)基購自北京奧博星生物。小鼠紅細(xì)胞（南京森貝伽生物科技有限公司），胃蛋白酶（MERCK）、胰蛋白酶（MERCK）。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、滅菌鍋（日立(中國)有限公司）、培養(yǎng)箱（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、厭氧罐（包括厭氧產(chǎn)期袋）（日本三菱化學(xué)株式會社）、搖床（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2 試劑配制及樣品處理

1.2.1 試劑的配制 培養(yǎng)基的配制按照各培養(yǎng)基標(biāo)簽要求進(jìn)行稱取和配制。人工胃液按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版Ⅳ部）配制：取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL 與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1 000 mL[12]。人工腸液按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版Ⅳ部）配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL 使溶解，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL[12]。

1.2.2 指示菌菌懸液的準(zhǔn)備 細(xì)菌復(fù)蘇：各指示菌菌種均平板劃線培養(yǎng)20 h（布氏桿菌培養(yǎng)5 d）；挑取單菌落相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12～14 h（布氏桿菌培養(yǎng)3 d），待用。指示菌稀釋：用生理鹽水將菌液稀釋至OD600吸光值為0.1（細(xì)菌約108CFU/mL，酵母菌約106CFU/mL），備用。

1.2.3 待測樣品處理 先配制抗菌肽產(chǎn)品原液，稱取1.28 g樣品定容于10 mL 容量瓶中，制成128 000 μg/mL 的樣品液，震蕩混合均勻，超聲波處理10 min。吸取適量上述溶液于具塞滅菌離心管中，5 000 r/min 離心2 min，取上清液于0.45 μm 濾膜過濾，取過濾液，將前面過濾的1 mL 左右液體棄去，收集后面過濾的液體，然后用無菌水進(jìn)行倍比梯度稀釋，其桿菌七肽濃度為6 400、3 200、1 600、800、400、200、100、50、25 μg/mL。

1.3 抑菌試驗(yàn) ①于超凈工作臺內(nèi)，向每個滅菌培養(yǎng)皿中傾注10 mL 的高壓滅菌過的水瓊脂（1.2%～1.5%瓊脂）進(jìn)行鋪底，每個培養(yǎng)皿厚度均一，待水瓊脂冷卻凝固后，將滅菌后的牛津杯（7.9 mm）置于瓊脂之上，每個平皿可等距離放置3～7 個牛津杯。②吸取150 μL 指示菌菌液（1.2.2 準(zhǔn)備的菌懸液）加入到恒溫至（50±5）℃的相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，避免起泡，此時菌在培養(yǎng)基的含量為106CFU/mL。 ③將上述加過菌液的瓊脂培養(yǎng)基倒入放有牛津杯的凝固的瓊脂培養(yǎng)皿中，每個平皿倒15～20 mL，待其冷卻凝固。用鑷子取出牛津杯，吸取150 μL 的待檢樣品注入到相應(yīng)的孔內(nèi)，設(shè)立滅菌水為空白對照，同時在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放入2～8℃冰箱內(nèi)放置1～2 h 進(jìn)行樣品的擴(kuò)散。④將培養(yǎng)皿移入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10 h 后（布氏桿菌培養(yǎng)時間約為5 d），觀察平板中的抑菌圈直徑，并用直尺或游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量抑菌圈直徑，同時用無菌水作為對照。布氏桿菌在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所P3 實(shí)驗(yàn)室操作，其他病原菌在P2 及實(shí)驗(yàn)室操作。

1.4 溫度對桿菌七肽抗菌活性的影響 取抗菌肽樣品12.8 g，定溶于100 mL 去離子水，分成4 份為1～4 號樣，每份25 mL，1～3 號樣分別與 70、80、90℃水浴處理 10 min，4 號樣為對照室溫放置。以大腸桿菌CGMCC44102 為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌試驗(yàn)同1.3。每個試驗(yàn)2 個重復(fù)。

表1 菌株來源及培養(yǎng)條件

1.5 體外消化對桿菌七肽抗菌活性的影響 取抗菌肽樣品1.28 g，定溶于10 mL 人工胃液中，開始計(jì)時，分別在30、60、120 min 不同時間點(diǎn)取樣加NaOH 中和pH為7，85℃處理5 min 滅活蛋白酶，然后梯度稀釋，以CGMCC44102 指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌試驗(yàn)同1.3。每個試驗(yàn)2 個重復(fù)。

取抗菌肽樣品1.28 g，定溶于10 mL 人工腸液中，開始計(jì)時，分別在30、60、120 min 不同時間點(diǎn)，85 ℃處理5 min 滅活蛋白酶然后梯度稀釋，以CGMCC44102 指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌試驗(yàn)同1.3。每個試驗(yàn)2 個重復(fù)。

1.6 溶血性試驗(yàn) 試驗(yàn)方法參考[13]：用PBS 調(diào)整小鼠紅細(xì)胞濃度為1%；在試管中用PBS 將桿菌七肽產(chǎn)品濃度調(diào)整為 2 000、1 000、500、250 μg/mL，加入等體積的紅細(xì)胞懸液，則濃度為1 000、500、250、125 μg/mL（對應(yīng)桿菌七肽為 100、50、25、12.5 μg/mL），以 PBS為陰性對照，以1% Tritonx-100 為陽性對照，37℃感作1 h，觀察試管渾濁度；1 000×g 離心5 min；將上清液依次加入96 孔板，測定OD540值。溶血率=（檢測孔OD540－陰性孔OD540）/（陽性孔OD540－陰性孔OD540）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 抑菌圈直徑、溶血率采用Excel 表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 桿菌七肽對不同微生物的抑制作用 通過對18 株不同微生物（10 株革蘭氏陰性菌，7 株革蘭氏陽性菌，1 株真菌）的抑制作用（表2）發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對10 株革蘭氏陰性菌都有抑制作用，如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、綠膿桿菌、副溶血弧菌、嗜水氣假單胞菌以及布氏桿菌，而只對2 株革蘭氏陽性菌具有抑制作用，即產(chǎn)期莢膜梭菌（又名魏氏梭菌）。同時發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對同種菌不同株或不同血清型的抑制效果也不盡相同，抗菌肽稀釋到50 μg/mL 對大腸桿菌和沙門氏菌有一定的抑制作用。抗菌肽稀釋到50 μg/mL 對副溶血弧菌NF1517 仍然有抑制作用，而抗菌肽稀釋到800 μg/mL 對副溶血弧菌ATCC17802 的抑菌圈消失，沒有抑制作用。桿菌七肽稀釋到50 μg/mL 對產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC3038仍然有抑菌圈，而桿菌七肽釋到200 μg/mL 對產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 沒有發(fā)現(xiàn)抑菌作用。同時，在本試驗(yàn)條件下，桿菌七肽對李斯特菌、金黃色葡萄球菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌均沒有抑制作用。

2.2 溫度對桿菌七肽抑菌活性的影響 由表3 可見，不同溫度（70、80、90℃）處理抗菌肽10 min 后稀釋成不同濃度，與對照（室溫放置）比較，桿菌七肽抑菌圈的直徑?jīng)]有發(fā)生明顯變化。

2.3 人工胃液、腸液對桿菌七肽抑菌活性的影響 由表4 可見，用人工腸液處理抗菌肽后稀釋成不同濃度，與未處理比較，60 min 之前，其抑菌圈直徑未發(fā)生明顯變化，90 min 時，抑菌圈減少0.5～1 mm，說明其抗菌肽活性稍微下降。表5 顯示，人工胃液處理抗菌肽后，稀釋成不同濃度與對照（0 min）比較，30 min 時其抑菌圈直徑輕微減小，但隨后（30～90 min）其抑菌圈的直徑?jīng)]有明顯變化，說明抗菌肽活性沒發(fā)生明顯變化。2.4 桿菌七肽溶血性試驗(yàn) 如表6 所示，不同濃度（12.5～100 μg/mL）桿菌七肽產(chǎn)品處理紅細(xì)胞，其溶血率均小于5%。

表2 桿菌七肽對不同菌株的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表3 不同溫度處理抗菌肽后的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表4 人工腸液處理抗菌肽后的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表5 人工胃液處理抗菌肽后的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表6 不同濃度抗菌肽產(chǎn)品對紅細(xì)胞溶血率 %

3 討 論

抑制腸道有害微生物生長被認(rèn)為是飼用抗生素促進(jìn)動物生長的重要作用機(jī)理之一，故對病原菌的抑制效果可作為飼用抗生素替代品的研究和評價的重要指標(biāo)[11]。管碟法能夠直觀看到抗菌藥物對指示菌的抑菌作用所形成的抑菌圈，因此被廣泛應(yīng)用在抗菌譜和抗菌活性測定的實(shí)驗(yàn)中，該方法簡單、快捷、成為抗菌物質(zhì)評價的重要方法[12]。對于同種抗菌劑，藥物濃度（或效價）與抑菌圈面積呈正比或直徑（diameter）的平方（D2）呈正比[13-15]，故抑菌圈直徑是評價指示菌對抗菌劑的敏感程度的重要指標(biāo)。抗菌譜是抗菌劑所能抑制和殺滅微生物的屬和種的集合，是抗菌肽的重要特性[16]。通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對受試的10 株革蘭氏陰性細(xì)菌都有抑菌作用，而只對7 株中的2 株革蘭氏陽性細(xì)菌有抑制作用，對革蘭氏陽性益生菌植物乳桿菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌也沒有抑制作用，說明桿菌七肽的抗菌譜主要為革蘭氏陰性細(xì)菌。

高溫制粒是飼料常用的加工方式，其可以減少飼料中的病原微生物、減少動物采食過程中的浪費(fèi)、提高飼料消化率。本試驗(yàn)通過高溫水浴處理模擬飼料高溫過程，發(fā)現(xiàn)桿菌七肽對大腸桿菌的抑制效果沒有發(fā)生變化，這表明桿菌七肽對于高溫具有很好的穩(wěn)定性，其活性可以耐受飼料的高溫制粒過程?？咕耐ㄟ^口服形式飼喂動物后在腸道起作用，必須具備耐受胃腸道的各種苛刻條件，而通過人工模擬腸胃液來體外評價是一種快速有效的方式。通過人工腸液和胃液處理?xiàng)U菌七肽發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑基本不受影響或影響很小，說明桿菌七肽在體外人工胃液和腸液中活性穩(wěn)定。溶血現(xiàn)象是指紅細(xì)胞被破壞后血紅蛋白被釋放出來，其反映了某種物質(zhì)對紅細(xì)胞細(xì)胞膜有破壞作用，從而反映了藥物的安全性。一些抗菌肽對動物細(xì)胞存在溶血性而無法臨床應(yīng)用[17-18]，故溶血性是評價抗菌肽安全性的重要指標(biāo)，溶血性通過測定溶血率來評價，溶血率小于5%，就認(rèn)為測試藥物沒有溶血性[18]。本研究通過溶血性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的桿菌七肽對紅細(xì)胞溶血率均小于5%，說明其紅細(xì)胞溶血率低，具有較好的安全性。以上結(jié)果表明，桿菌七肽對細(xì)菌具有明顯的抑制作用，其穩(wěn)定性和安全性較高，體外試驗(yàn)的抑制效果能否在體內(nèi)腸道中體現(xiàn)，同時能否在生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)生長的作用，需要通過動物飼喂試驗(yàn)和對生產(chǎn)性能、腸道微生物以及其免疫指標(biāo)的測定而得出替代某種或者某類飼用抗生素的結(jié)論。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，桿菌七肽是一種抗菌譜主要為革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌肽，對蛋白酶和熱處理具有很好的耐受性，紅細(xì)胞溶血率低，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，能否有效替代飼用抗生素，需要體外試驗(yàn)進(jìn)一步研究，而具體的替代飼用抗生素可行性和方案，有待于結(jié)合動物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。