張小敏， 陳飛云， 張學(xué)成， 何 超， 肖亞中

(安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 現(xiàn)代生物制造安徽省重點(diǎn)實驗室 安徽省微生物與生物催化工程技術(shù)研究中心， 合肥 230601)

糖苷水解酶(Glycoside hydrolases, GH, EC3.2.1)普遍分布于自然界的所有生物體中，可以依照內(nèi)切或外切的方式水解各種含糖化合物的糖苷鍵，包括淀粉、纖維素、寡糖以及小分子糖苷等碳水化合物，也可以通過修飾相應(yīng)的糖類化合物來發(fā)揮功能[1-3]。至今，已知的糖苷水解酶有2000多種，而根據(jù)氨基酸的序列比對和分析，將其分成156個不同的家族[4]。依據(jù)糖苷水解酶催化底物分子異頭碳構(gòu)型是否發(fā)生轉(zhuǎn)變，將其分為反轉(zhuǎn)和保留兩種催化類型：在反轉(zhuǎn)催化機(jī)制中，酶分子上的一對羧基分別作為廣義酸和廣義堿[5-7]。糖苷鍵上的氧親核攻擊廣義酸上的氫；而廣義堿協(xié)助水分子親核攻擊底物糖分子的異頭碳，糖基從糖鏈上解離出來，這種催化方式使水解出的單糖產(chǎn)物構(gòu)型發(fā)生了轉(zhuǎn)變[5，8]。在保留催化機(jī)制中，酶分子上的一對羧基分別充當(dāng)廣義酸堿和親核體，采用雙置換機(jī)制，經(jīng)過糖基化和去糖基化兩步反應(yīng)保持水解產(chǎn)物的構(gòu)型不變完成催化反應(yīng)[6]。

一般來說，每個家族的內(nèi)部成員被認(rèn)為具有共同的祖先和相似的三級結(jié)構(gòu)，催化殘基和催化機(jī)制是保守的[9-12]。然而GH97家族的不同尋常之處在于它同時擁有“反轉(zhuǎn)”和“保留”兩種催化類型的成員[13-15]。目前為止，GH97家族共有1369條基因序列，其中有1334條來自于細(xì)菌，18條則來源于古生菌，有一條基因序列屬于真核生物，剩下的16條基因序列暫未被分類。在GH97家族中，結(jié)構(gòu)和功能研究比較深入的僅有α-葡萄糖苷酶BtGH97a、α-半乳糖苷酶BtGH97b、β-L-阿拉伯糖吡喃糖苷/α-D-吡喃半乳糖苷雙功能酶BT3661[16]和α-葡萄糖苷酶PspAG97A。其中BtGH97a和BtGH97b均來自多形擬桿菌屬Bacteroidesthetaiotaomicron，擁有(β/α)8桶狀折疊結(jié)構(gòu)域和相似的催化結(jié)構(gòu)域，卻執(zhí)行不同的催化機(jī)制[5,13,17]。在已解析的GH97家族成員分子結(jié)構(gòu)中，活性中心都包含一個保守的鈣離子，該鈣離子在催化過程中發(fā)揮重要作用[13,18]。目前，GH97家族成員被深入研究的相對較少，該家族的祖先執(zhí)行何種機(jī)制，“反轉(zhuǎn)”和“保留”兩種催化類型如何分化仍不清楚。

課題組前期從來源于北極海洋的假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.K8)中克隆一新型α-葡萄糖苷水解酶基因，在大腸桿菌活性表達(dá)得到重組酶PspAG97A，根據(jù)序列相似性分析將其歸入GH97家族[19-20]。研究表明PspAG97A是一種嗜鹽酶，具有耐受高濃度NaCl的能力，在1 mol/L NaCl/KCl存在下具有最大酶活性[19]。有文獻(xiàn)報道，GH31家族中來源于嗜鹽古菌Haloquadratumwalsbyi的α-葡萄糖苷水解酶MalH在3 mol/L NaCl或3～4 mol/L KCl存在下，酶活性值最高[21]。鹵素離子依賴是古生物適應(yīng)古地球高鹽環(huán)境的一種體現(xiàn)，推測PspAG97A可能代表GH97家族中較為古老的成員。我們解析了PspAG97A的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其活性中心除了保守的鈣離子，還包含一個氯離子。該氯離子幫助穩(wěn)定部分底物結(jié)合位點(diǎn)[20]。從序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測PspAG97A屬于反轉(zhuǎn)催化類型，但尚未實驗驗證。本文擬對PspAG97A進(jìn)行研究，通過HPLC分析鑒定PspAG97A的催化類型，擴(kuò)充人們對于GH97家族成員的認(rèn)識；利用理性設(shè)計、定點(diǎn)突變、酶學(xué)性質(zhì)分析等研究方法初步探究GH97家族兩種催化機(jī)制類型的轉(zhuǎn)化可能性，為GH97家族酶兩種催化類型進(jìn)化關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

pET22b (+)-PspAG97A重組質(zhì)粒為本實驗室在前期研究工作中所構(gòu)建，其中PspAG97A基因(GenBank登錄號：AMB20699.1)克隆自北極海洋細(xì)菌交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)中產(chǎn)α-葡萄糖苷水解酶的陽性菌P.haloplankitsK8。大腸桿菌E.coliBL21(DE3)由本實驗室保存。MutanBEST Kit試劑盒購于TaKaRa公司；引物的合成與測序由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成；DNA凝膠回收試劑盒、DNA質(zhì)粒抽提試劑盒購于康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；pNPαG購于阿拉丁上海生物股份科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 PspAG97A突變體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)PspAG97A的基因序列設(shè)計4對定點(diǎn)突變引物。以pET22b (+)-PspAG97A重組質(zhì)粒為模板，分別采用表1中的引物克隆構(gòu)建出目標(biāo)突變酶基因。PCR擴(kuò)增條件如下：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸7 min 30 s，30個循環(huán)數(shù)；72 ℃延伸10 min。根據(jù)TaKaRa MutanBEST Kit點(diǎn)突變試劑盒的原理，將導(dǎo)入變異點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端平滑化和5′磷酸化處理，再使用連接試劑Ligation Solution I進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子并由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序驗證，獲得目標(biāo)突變菌體：G407D、E377G/G407D、G407D/E456G、E377G/G407D/E456G、G407E、E377G/G407E、G407E/E456G、E377G/G407E/E456G。

1.3 重組酶和突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組酶PspAG97A及突變酶表達(dá)菌分別接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。按1%(V/V)的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至400 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)18 h。并于4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min收集菌體。

表1 構(gòu)建突變菌所用引物

用20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.5的緩沖液洗滌并重懸菌體，采用高壓均質(zhì)機(jī)對菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，4 ℃、10 000 r/min，離心30 min收集上清液，即為重組酶與突變酶的粗酶液。

采用Ni2+-NTA親和層析進(jìn)行蛋白純化，含200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫獲得純化后的目標(biāo)蛋白。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Bradford法分別檢測重組蛋白的純度和含量。

1.4 PspAG97A水解產(chǎn)物異頭碳構(gòu)型分析

通過HPLC檢測重組酶PspAG97A水解pNPαG產(chǎn)物的異頭形式。酶反應(yīng)在1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4，0.8 mol/L NaCl，pH 7.5條件下進(jìn)行，酶濃度為45.6 μmol/L，在35 ℃水浴鍋中分別孵育不同時間后立即冰浴終止反應(yīng)。將等分反應(yīng)液(10 μL)上樣至正相色譜柱TSK-gel Amide 80(4.6×250 mm, Tosoh, Tokyo, Japan)，用80%乙腈/水洗脫，流速為1 mL/min,室溫下分析反應(yīng)混合物隨時間的變化。使用蒸發(fā)光散射檢測器(Agilent 1260 Infinity ELSD，美國)檢測產(chǎn)物。通過D-葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品確認(rèn)α-和β-葡萄糖的保留時間。

1.5 PspAG97A與突變酶的酶活力大小測定

將緩沖液(1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.5)、100 μL 25 mmol/LpNPαG、100 μL 4 mol/L NaCl在35 ℃條件下預(yù)熱5 min后分別加入10 μL酶液，反應(yīng)10 min后加入500 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。實驗組做3個平行實驗，以緩沖液代替酶液做空白對照并調(diào)零，測定405 nm下的光吸收值。3個平行樣品取平均值后，依據(jù)公式計算酶活性和比酶活。一個酶活力單位(U)定義為：一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化水解底物產(chǎn)生1 μmoLpNP所需要的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PspAG97A突變位點(diǎn)的選擇

使用Pymol軟件對PspAG97A與GH97家族中執(zhí)行保留類型催化機(jī)制的α-半乳糖苷水解酶BtGH97b進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對分析，仿照保留類型的催化裝置，將PspAG97A催化中心的Gly407突變?yōu)閷?yīng)于BtGH97b中的Asp415，使其作為親核體。而Glu480作為廣義酸堿，先后執(zhí)行酸催化和堿催化的作用。并將PspAG97A的催化堿基Glu377、Glu456突變?yōu)閭?cè)鏈較短的Gly使其不影響G407D的側(cè)鏈伸展，構(gòu)建G407D單點(diǎn)突變體、E377G/G407D兩點(diǎn)突變體、G407D/E456G兩點(diǎn)突變體和E377G/G407D/E456G三點(diǎn)突變體。此外，也嘗試將Gly407突變?yōu)橛杏H核基團(tuán)的Glu，并與催化堿基Glu377、Glu456組合突變，構(gòu)建G407E單點(diǎn)突變體、E377G/G407E兩點(diǎn)突變體、G407E/E456G兩點(diǎn)突變體、E377G/G407E/E456G三點(diǎn)突變體。

A為PspAG97A-阿卡波糖復(fù)合物的催化活性中心示意圖(黃色代表阿卡波糖，品紅色代表催化氨基酸，藍(lán)色代表催化中心的氨基酸);B為PapAG97A與BtGH97b催化中心疊加示意圖(正體字母代表PspAG97A的催化氨基酸，斜體字母代表BtGH97b的催化氨基酸)

圖1 PspAG97A結(jié)構(gòu)示意圖

Figure 1 The structure diagram of PspAG97A

2.2 重組酶與突變酶的分離純化

將表達(dá)重組酶PspAG97A和構(gòu)建獲得的8種突變酶(G407D、E377G/G407D、G407D/E456G、E377G/G407D/E456G、G407E、E377G/G407E、G407E/E456G、E377G/G407E/E456G)的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化后的SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖2所示，重組酶與突變酶的分子量約為75.6 ku，大小與理論分子質(zhì)量相符。

2.3 PspAG97A催化機(jī)制的分析

α-葡萄糖苷酶PspAG97A以外切的方式水解底物非還原末端，斷開α-1, 4-糖苷鍵釋放出一分子葡萄糖。通過HPLC方法檢測了PspAG97A降解pNPαG降解產(chǎn)物的異頭碳形式。如圖3所示，在反應(yīng)初始階段，酶催化底物pNPαG水解產(chǎn)生β-D-葡萄糖。隨著酶反應(yīng)時間的增加，α型:β型葡萄糖的比例逐漸增大。這表明PspAG97A酶催化底物水解出的產(chǎn)物為β-D-葡萄糖，隨后發(fā)生變旋現(xiàn)象，β-D-葡萄糖的量開始下降，并產(chǎn)生α-D-葡萄糖直至兩者達(dá)到動態(tài)平衡。此時旋光度不再變化，β-D-葡萄糖較穩(wěn)定，約占64%，α-D-葡萄糖較不穩(wěn)定，約占36%。證明水解的反應(yīng)在異頭位置進(jìn)行立體化學(xué)反轉(zhuǎn)，PspAG97A是一種反轉(zhuǎn)型糖苷水解酶。三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)暗示其活性結(jié)構(gòu)中心的E480作為催化酸提供質(zhì)子，E377和E456充當(dāng)催化堿協(xié)助水分子親核攻擊異頭碳，使水解產(chǎn)物單糖的構(gòu)型發(fā)生了改變。

M: Marker； 泳道1：重組酶PspAG97A； 泳道2～9分別表示突變酶G407D、E377G/G407D、G407D/E456G、E377G/G407D/E456G、G407E、E377G/G407E、G407E/E456G、E377G/G407E/E456G

圖2 重組酶與突變酶的SDS-PAGE檢測分析

Figure 2 SDS-PAGE analysis of wild type and mutant enzymes

A為PspAG97A水解產(chǎn)物的HPLC分析，PspAG97A與pNPαG在1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4，0.8 mol/L NaCl，pH 7.5條件下，于35 ℃分別反應(yīng)5、10和15 min。立即冰浴終止并進(jìn)行HPLC檢測分析。B為A圖的放大圖

圖3 PspAG97A水解產(chǎn)物異頭碳構(gòu)型分析

Figure 3 Analysis of anomeric carbon configuration of PspAG97A hydrolysate

2.4 PspAG97A與突變酶的酶活力分析

以pNPαG作為底物，重組酶PspAG97A作為對照，測定突變酶水解底物的活力大小，并運(yùn)用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。從圖4可以看出，突變酶的比活力與重組酶相比降低了100倍以上，差異顯著(P<0.05)。而突變酶之間相比，差異不顯著(P>0.05)。這說明位于活性中心的位點(diǎn)Glu377、Gly407和Glu456對于穩(wěn)定催化口袋的空間構(gòu)象起到關(guān)鍵作用，而催化堿殘基Glu377、Glu456直接參與水解反應(yīng)，對于這些位點(diǎn)的突變破壞了酶與底物的結(jié)合。

1～9分別為：PspAG97A、G407D、E377G/G407D、G407D/E456G、E377G/G407D/E456G、G407E、E377G/G407E、G407E/E456G、E377G/G407E/E456G；圖中不同字母表示有顯著性差異( P ＜ 0. 05)

圖4 PspAG97A與催化類型轉(zhuǎn)變相關(guān)突變體的酶活力大小

Figure 4 Enzyme activity of PspAG97A and catalytic type transformation related mutants

3 討論與結(jié)論

糖苷水解酶通過兩種機(jī)制催化底物水解，導(dǎo)致切割位點(diǎn)立體化學(xué)的整體保留或倒置，該機(jī)制在每個家族是保守的，GH1、GH13、GH22、GH31等家族均采用保留機(jī)制，而GH6、GH15、GH37、GH45等家族則采用反轉(zhuǎn)機(jī)制[22-23]。GH97家族是一個極為特殊的家族，已被證明其包含兩個亞家族，分別對應(yīng)“反轉(zhuǎn)”和“保留”催化類型，這顯示出GH97家族在催化機(jī)制上的進(jìn)化分歧[5]。本文首次對GH97家族成員PspAG97A的催化機(jī)制進(jìn)行分析，通過Ni2+-NTA親和層析的方法純化獲得PspAG97A蛋白，采用高效液相色譜檢測其催化產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)型，結(jié)果說明PspAG97A執(zhí)行反轉(zhuǎn)催化機(jī)制，這與催化基團(tuán)的空間分布相吻合。

為了對GH97家族兩種催化機(jī)制的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，本文擬根據(jù)PspAG97A晶體結(jié)構(gòu)，理性改造PspAG97A的催化類型，使其從反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ａ簟Ｓ醒芯繄蟮?，T4噬菌體溶菌酶催化中心的廣義堿Thr26被His取代后，可實現(xiàn)反轉(zhuǎn)機(jī)制到保留機(jī)制的轉(zhuǎn)變，并賦予該酶轉(zhuǎn)糖苷活性[24]。本文通過將PspAG97A分別與同一家族成員BtGH97a(反轉(zhuǎn)類型)和BtGH97b(保留類型)進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對，仿照保留類型的催化裝置對相關(guān)位點(diǎn)E377、G407、E456進(jìn)行單點(diǎn)和組合突變，嘗試改造催化機(jī)制。結(jié)果顯示這些突變體比酶活均降低100倍以上，說明這些位點(diǎn)突變后，大幅度降低了酶對底物的結(jié)合能力和催化活力。目前的檢測方法還不足以鑒定出這些突變體的催化類型是否已發(fā)生轉(zhuǎn)變。在催化中心，E377和E456作為催化堿，直接參與水解反應(yīng)。而G407位于催化堿附近，對于維持活性口袋的空間構(gòu)象起到至關(guān)重要的作用。

后續(xù)對于PspAG97A催化機(jī)制的進(jìn)一步改造，一方面，將通過使用超高效液相色譜(UPLC)以增加產(chǎn)物分離的靈敏度和分離度，或通過核磁共振一維譜1H NMR并優(yōu)化條件嘗試對現(xiàn)有突變體進(jìn)行分析。另一方面，PspAG97A保留類型催化機(jī)制的實現(xiàn)可能需要更小的活性中心底物結(jié)合口袋，需對其進(jìn)行更為精細(xì)化的位點(diǎn)設(shè)計。課題組已經(jīng)通過生物信息學(xué)的方法得到一條GH97家族進(jìn)化上的祖先序列。此外GH97家族存在一些特殊序列，不含與保留或反轉(zhuǎn)類型對應(yīng)的特征基序。這些信息為我們研究GH97家族催化機(jī)制的分化提供了新的線索和思路，對于GH97家族兩種催化類型機(jī)制的進(jìn)化關(guān)系的研究工作具有十分重要的意義和價值。