陳 梅，馮 藝，陳文強(qiáng)，區(qū)慶淦，陳建酬

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231)

藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)(Lepomismacrochirus)屬鱸形目太陽(yáng)魚(yú)科，原產(chǎn)于美國(guó)，于1987年首次引進(jìn)我國(guó)[1]。其屬溫水性小體型魚(yú)類，肉質(zhì)鮮美，口感好，無(wú)肌間刺，生長(zhǎng)適溫范圍廣(1～38 ℃)，食性雜，適應(yīng)性強(qiáng)，易于養(yǎng)殖，是一種集食用、游釣、觀賞于一體的淡水名貴魚(yú)類[2]，具有較大的市場(chǎng)價(jià)值。

諾卡氏菌(Nocardia)是介于細(xì)菌與真菌間的革蘭氏陽(yáng)性菌，常將其歸類為細(xì)菌，屬于放線菌門(mén)諾卡氏菌科諾卡氏菌屬，以腐生為主，是一種人獸共患的慢性傳染病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面危害極大[3]。魚(yú)類諾卡氏菌病的致病菌主要有鰤?mèng)~諾卡氏菌(N.seriolae)[4]、星狀諾卡氏菌(N.asteroides)[5]和殺鮭諾卡氏菌(N.salmonicida)[6]。其中，以鰤?mèng)~諾卡氏菌為主[7]。鰤?mèng)~諾卡氏菌是一種條件致病菌，在魚(yú)體免疫力低下時(shí)，很容易通過(guò)餌料、鰓、傷口感染，主要癥狀是病魚(yú)真皮下會(huì)形成膿瘡，有干酪狀壞死情況，鰓上有絮狀結(jié)節(jié)，最明顯是脾臟和腎臟上有大量肉眼可見(jiàn)的白色結(jié)節(jié)，肝、心和鰾上也可見(jiàn)結(jié)節(jié)[8]。在已有的報(bào)道中，諾卡氏菌對(duì)烏鱧(Ophicephalussargus)[9]、加州鱸(Micropterussalmonides)[10]、招財(cái)魚(yú)(Osphronemusgoramy)[11]、大黃魚(yú)[12]等造成了極大的危害，而藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)的諾卡氏菌病在國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)患病藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)內(nèi)臟進(jìn)行了病原菌的分離鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特征及致病性進(jìn)行了相關(guān)的研究，旨在為養(yǎng)殖藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)諾卡氏菌病的防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)病樣采自佛山市順德區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)(15.3±1.1)cm，體質(zhì)量(80.3±5.5)g。健康藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)(80.1±5.3)g/尾，購(gòu)自佛山市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。

試驗(yàn)用腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、瓊脂粉、細(xì)菌微量生化鑒定管均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及PCR所用的試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。特異性引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。藥物敏感紙片購(gòu)自杭州濱和微生物有限公司。

1.2 病原菌分離純化

無(wú)菌狀態(tài)下，從患病藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)的肝臟、腎臟和脾臟中挑取黃豆大小的組織塊，輕輕涂抹在BHI培養(yǎng)基上，再劃線分離菌株，25 ℃ 恒溫培養(yǎng)3-7 d。挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落在BHI平板上劃線分離純化1～2次，獲得純培養(yǎng)物，接種于BHI肉湯培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)3 d后，加入30%無(wú)菌甘油，置于-80 ℃保存。

1.3 回歸感染試驗(yàn)

健康藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)暫養(yǎng)一周，水溫控制在25 ℃，連續(xù)充氣增氧，無(wú)異常情況后進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。90尾健康藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)分為兩組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行15尾。將菌株SD1810液體培養(yǎng)3 d，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為2.8×107CFU/mL，按照0.2 mL/尾的劑量對(duì)藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)進(jìn)行腹腔注射；對(duì)照組藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)則按相同的劑量在相同的部位注射無(wú)菌生理鹽水。連續(xù)觀察40 d，每天正常喂養(yǎng)、充氧、吸污、換水，同時(shí)觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況，對(duì)患病藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)重新進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.4 病原菌生理生化特征

在BHI瓊脂培養(yǎng)基中將菌株SD1810進(jìn)行平板劃線，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等。同時(shí)，按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。將菌株SD1810接種于BHI肉湯中振蕩(120 r/min)培養(yǎng)3 d后，根據(jù)細(xì)菌生化鑒定管的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)菌各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.5 病原菌16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

將菌株SD1810接種于BHI肉湯振蕩(120 r/min)培養(yǎng)3 d后，1 000 r/min離心收集菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取該菌的總DNA作為PCR反應(yīng)的模板。采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴(kuò)增分離菌株SD1810的16 S rRNA基因序列。反應(yīng)體系為50 μL，包括：mix 25 μL，ddH2O 19 μL，濃度為10 μmol/L的正反向引物各1 μL，菌株總模板DNA 4 μL；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序得到菌株SD1810的16S rRNA基因序列在NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進(jìn)行BLAST比對(duì),利用MEGA7.0軟件中的Clustal W模式進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，再用Neighbor-joining法構(gòu)建分子生物進(jìn)化樹(shù)。

1.6 藥敏試驗(yàn)

以無(wú)菌生理鹽水將菌株SD1810的3 d培養(yǎng)物稀釋成1.7×108CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液涂布于BHI瓊脂平板中，采用K-B紙片擴(kuò)散法，用無(wú)菌鑷子將抗生素藥敏紙片輕輕貼在培養(yǎng)基表面，每平板放置3片，25 ℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量抑菌圈直徑(mm)。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的形態(tài)特征

從脾臟分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌株SD1810為革蘭氏陽(yáng)性分枝桿菌，無(wú)運(yùn)動(dòng)性。在BHI瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3～5 d可見(jiàn)白色沙粒狀菌落，其單菌落較小、表面干燥，顯微鏡下可觀察到灰黑色菌落，邊緣不整齊(圖1)。接種到BHI液體培養(yǎng)基上靜置培養(yǎng)3 d后，菌液澄清透明，底部有少量白色菌體沉淀。

圖1 菌株SD1810菌落及菌體形態(tài)Fig.1 Colony and morphology of strain SD1810a.菌株SD1810菌落形態(tài)；b.菌株SD1810顯微鏡下菌落形態(tài)；c.菌株SD1810菌體形態(tài)

2.2 回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)人工感染發(fā)病藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)15 d后開(kāi)始死亡，病死魚(yú)的主要癥狀與自然發(fā)病藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)癥狀相似，其體表潰爛出血，有膿瘡，鰓絲有少量白色結(jié)節(jié)(圖2a)。解剖后，肝臟、脾臟、腎臟均有大量白色結(jié)節(jié),如圖2 b所示。從死亡藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)的肝臟、腎臟以及脾臟中均可分離到與原致病菌形態(tài)相一致的菌株，在生理生化特性方面完全相同。注射無(wú)菌生理鹽水的對(duì)照藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)無(wú)死亡現(xiàn)象，外觀特征無(wú)明顯變化，剖檢也未發(fā)現(xiàn)任何病理變化。人工感染試驗(yàn)結(jié)果如表1。

圖2 患病太陽(yáng)魚(yú)臨床癥狀Fig.2 Clinical symptoms of diseased L.macrochirusa.示病魚(yú)體表潰爛；b.示病魚(yú)肝臟有大量白色結(jié)節(jié)

2.3 病原菌生理生化特征

由表2可知，病原菌SD1810氧化酶陰性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，產(chǎn)生脲酶，還原硝酸鹽，水解明膠，不水解淀粉，水解七葉靈，能以檸檬酸鹽為唯一碳源生長(zhǎng)，不能利用甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇，不具運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，該分離菌株具備諾卡氏菌屬的基本生理生化特征，且與鰤?mèng)~諾卡氏菌大致相同[7]，可初步鑒定為鰤?mèng)~諾卡氏菌。

表1 人工感染試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Test results of artificial injection

表2 藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)病原菌及參照菌株的生理生化特性Tab.2 Physiological and biological characteristics of isolate SD1810 from L.macrochirus and reference strains of Nocardia

注：“+”陽(yáng)性；“-”陰性

2.4 16S rRNA基因序列分析

采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R擴(kuò)增得到1 500 bp左右的基因片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖3。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表3。同源性檢索結(jié)果表明，菌株SD1810與諾卡氏菌屬的鰤?mèng)~諾卡氏菌核苷酸同源性高達(dá)100%。選取17株相關(guān)性較高的細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖4)。菌株SD1810與鰤?mèng)~諾卡氏菌MS00018聚為一支，而與其他N.takedensis，N.crassostreae，N.pseudobrasiliensis，N.uniformis等菌株距離較遠(yuǎn)。結(jié)合菌株的形態(tài)及生理生化特性，鑒定該菌株為鰤?mèng)~諾卡氏菌。

圖3 16S rRNA PCR結(jié)果Fig.3 Results of 16S rRNA amplification

2.5 藥物敏感試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明所分離的菌株SD1810對(duì)紅霉素、慶大霉素、氯霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、氟苯尼考、硫酸新霉素、利福平高度敏感；對(duì)呋喃唑酮中度敏感；但對(duì)頭孢唑啉、諾氟沙星、青霉素、恩諾沙星、阿莫西林和氨芐青霉素有耐藥性，結(jié)果如表4。

表3 SD1810菌株的16S rRNA基因片段序列Tab.3 16S rRNA gene segment sequence of strain SD1810

續(xù)表3

圖4 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Citrobacter species and other bacterium based on 16S rRNA sequences

3 討論

在自然界中，諾卡氏菌分布廣泛，土壤、活性污泥、水體中均有發(fā)現(xiàn)[13]，諾卡氏菌由于其潛伏期長(zhǎng)，傳染性強(qiáng)，在低溫季節(jié)容易爆發(fā)，目前尚無(wú)有效的治療方法，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的危害極大。鰤?mèng)~諾卡氏菌引發(fā)的諾卡氏菌病在中國(guó)地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[14]，在魚(yú)體免疫力低下或體表有傷口時(shí)特別容易感染。魚(yú)體感染諾卡氏菌后典型的癥狀是腎臟、肝臟、脾臟、鰓等器官出現(xiàn)慢性肉芽腫[15]。有學(xué)者認(rèn)為，諾卡氏菌生長(zhǎng)繁殖緩慢，延長(zhǎng)病程，致使細(xì)菌與壞死組織周?chē)饾u形成結(jié)締組織包膜，防止細(xì)菌擴(kuò)散，作為機(jī)體的保護(hù)，從而形成結(jié)節(jié)；此外，細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)使巨噬細(xì)胞和炎性細(xì)胞的增多導(dǎo)致慢性結(jié)節(jié)中心壞死[16]。魚(yú)類結(jié)節(jié)致病菌除了諾卡氏菌外還有舒伯特氣單胞菌[17]，但兩者所形成的結(jié)節(jié)不一樣，諾卡氏菌形成的結(jié)節(jié)界限明顯，有突起感，能導(dǎo)致組織硬化；而舒伯特氣單胞菌所形成的結(jié)節(jié)界限不明顯，不引起組織硬化。藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)的諾卡氏菌病在每年的春季和秋季均可爆發(fā)，水溫在25～28 °C時(shí)尤為嚴(yán)重?；疾∷{(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)體表有潰爛出血，嚴(yán)重者鱗片脫落，形成較大的膿瘡，鰓、內(nèi)臟組織和器官有大量白色結(jié)節(jié)，與已報(bào)道的烏鱧[9]、加州鱸[10]等諾卡氏菌病的癥狀相一致。在本次病例中，發(fā)病藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)食欲下降，游動(dòng)緩慢，魚(yú)體發(fā)黑，體表潰爛有膿瘡，白色結(jié)節(jié)主要集中在腎臟、肝臟以及脾臟，病灶處組織較硬，其發(fā)病適溫約25 ℃，發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)。對(duì)分離的致病菌進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化鑒定，結(jié)果均符合鰤?mèng)~諾卡氏菌的特征。通過(guò)16S rRNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，SD1810與鰤?mèng)~諾卡氏菌核苷酸的同源性高達(dá)100%，與菌株MS00018親緣關(guān)系最近，確定該菌為鰤?mèng)~諾卡氏菌。

表4 鰤?mèng)~諾卡氏菌SD1810的藥物敏感性Tab.4 Sensitivity of SD1810 strain to 11 kinds of antibiotics

注：S表示高度敏感；M表示中度敏感；R表示不敏感

鰤?mèng)~諾卡氏菌有兩種類型，一種對(duì)紅霉素敏感，為α葡萄糖苷酶陽(yáng)性菌；另一種對(duì)土霉素敏感，為α葡萄糖苷酶陰性菌[18]。本試驗(yàn)分離的鰤?mèng)~諾卡氏菌株對(duì)紅霉素敏感，可歸類為α葡萄糖苷酶陽(yáng)性菌。另外，SD1810也對(duì)慶大霉素、利福平、氯霉素、阿米卡星、氟苯尼考等10種抗生素敏感，但對(duì)頭孢唑啉、諾氟沙星、青霉素、阿莫西林、氨芐青霉素等6種抗生素具有耐藥性，與林偉[11]蔣依依[10]徐曉麗[19]等的研究結(jié)果不盡相同，這可能與不同地區(qū)、不同魚(yú)源的諾卡氏菌病的用藥情況有所不同所致，且細(xì)菌具有捕獲并整合其他菌源的耐藥基因的能力[20]，這就使得不同地區(qū)的致病菌耐藥性不一樣。在水產(chǎn)領(lǐng)域中，對(duì)鰤?mèng)~諾卡氏菌病的控制仍處于探索階段。對(duì)于α葡萄糖苷酶陰性菌感染的魚(yú)，可在飼料中添加乙酰-D-氨基葡萄糖或檸檬酸，增強(qiáng)病魚(yú)對(duì)土霉素的吸收，從而提高療效[21，22]。抗生素過(guò)多的使用容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，而且大多數(shù)抗生素屬于水產(chǎn)禁用藥[23]。由此，當(dāng)前對(duì)諾卡氏菌藥物治療方面的研究多集中在疫苗的研發(fā)領(lǐng)域，以降低水產(chǎn)行業(yè)對(duì)藥物的依賴。有研究發(fā)現(xiàn)，諾卡氏菌活疫苗、滅活疫苗以及重組γ干擾素均能有效地誘發(fā)魚(yú)體保護(hù)性免疫[24]，卡介苗對(duì)日本牙鲆諾卡氏菌病也有免疫作用[25]。Ho等[26]對(duì)諾卡氏菌基因疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，NGL3388基因編碼的蛋白能顯著提高魚(yú)體內(nèi)諾卡氏菌病的抗體滴度，但時(shí)效較短，只有2周時(shí)間。雖然學(xué)術(shù)界對(duì)諾卡氏疫苗的研究已取得一定的成果，但所得疫苗具有免疫時(shí)間短、毒性強(qiáng)、抗原量大，成本高等缺點(diǎn)，未能實(shí)現(xiàn)商品化，還需要進(jìn)一步研發(fā)安全性高，經(jīng)濟(jì)效益大的核酸疫苗、亞單位疫苗與多肽疫苗等。