陸 健，張佳佳，王佩佩，周國勤，慶 輝

(南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，南京 210036)

溫度作為一個重要的環(huán)境因子，在生物的生長、發(fā)育、形態(tài)、行為、數(shù)量和分布等方面起著極其重要的作用[1]。魚類作為變溫動物，其生長發(fā)育等所有的生理過程皆會受到環(huán)境因素的影響。先前的研究表明，在一定的適應(yīng)范圍內(nèi)，較高的溫度能促進(jìn)魚苗的生長，從而帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益[2,3]。但如果水溫在短時間內(nèi)急劇波動，魚類會因不能立即適應(yīng)新的環(huán)境而導(dǎo)致死亡，同時魚類體中的蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)在高溫下會變性失活，造成魚體抵抗力變?nèi)醵劳鯷4]。近年來，由于人類過渡的破壞，包括森林砍伐、耕地活動和工業(yè)生產(chǎn)導(dǎo)致內(nèi)陸環(huán)境溫度總體升高，從而導(dǎo)致全球氣候的變化、極端天氣的頻現(xiàn)。生產(chǎn)活動中，由夏季連續(xù)高溫、極端天氣等事件引起的魚類致死事件已有報道[5,6]，因此探究急性高溫下魚類生理變化機(jī)制對于魚類的健康養(yǎng)殖具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)“優(yōu)鱸3號”(GS-01-001-2018)是2019年經(jīng)全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定通過的新品種之一，是以“優(yōu)鱸1號”(GS01-004-2010)和從美國新引進(jìn)的北方亞種為基礎(chǔ)選育種群，采用群體選育和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，經(jīng)連續(xù)4代選育而獲得。在投喂人工配合飼料的養(yǎng)殖條件下，與“優(yōu)鱸1號”和未選育群體相比，“優(yōu)鱸3號”稚魚馴化時間明顯縮短，幼魚和成魚的生長速度較快，養(yǎng)殖5～7個月即可達(dá)到上市規(guī)格，適合在我國淡水水域進(jìn)行人工配合飼料養(yǎng)殖[7]?！皟?yōu)鱸3號”作為水產(chǎn)領(lǐng)域的新星，將會迎來廣闊的養(yǎng)殖前景，但關(guān)于其研究還較少，目前尚未見到有關(guān)“優(yōu)鱸3號”在溫度脅迫下的各項機(jī)能反應(yīng)的報道。同時，肝臟作為魚類最主要的代謝器官，在魚類適應(yīng)溫度變化的過程中發(fā)揮重要作用[8]。因此本文以大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”為研究對象，探究了其在急性溫度脅迫下的存活率、肝臟抗氧化酶活性和非特異性免疫應(yīng)答，旨在為大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”應(yīng)對高溫脅迫的機(jī)制和健康高效養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗處理

實(shí)驗所用大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”幼魚(體質(zhì)量(9.87±1.2)g，體長(7.9±0.4)cm)均來自江蘇南京帥豐飼料有限公司，將實(shí)驗用魚暫養(yǎng)于有生物過濾水再循環(huán)系統(tǒng)(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時間為14 h)的水族箱中。每天投喂兩次(8∶00～9∶00和20∶00～21∶00)江蘇南京帥豐飼料有限公司“優(yōu)鱸3號”專用飼料。整個暫養(yǎng)和實(shí)驗期間水體溶氧高于5 mg/L，氨氮與亞硝酸鹽低于0.01 mg/L，實(shí)驗前禁食24 h，實(shí)驗期間不投喂。

將各組幼魚在25 ℃水溫下暫養(yǎng)15 d后，對照組水溫保持在該溫度下恒定。將實(shí)驗組迅速轉(zhuǎn)入預(yù)調(diào)好水溫的水循環(huán)缸中(31 ℃、34 ℃、37 ℃)，每個實(shí)驗組包括四個平行，每個平行含有30尾幼魚，在相應(yīng)的實(shí)驗水溫下保持至實(shí)驗結(jié)束，并于0、1、3、6、12、24、48 h記錄死亡幼魚個體數(shù)量。同時取6條幼魚的肝臟組織于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃中保存，用于酶活力的測定。

1.2 酶活性測定

準(zhǔn)確稱取0.1 g肝組織，按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入0.9 mL的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液為10%的組織勻漿液，分裝置于-20 ℃冰箱備用。組織樣品的蛋白濃度、總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按照實(shí)際濃度做微小調(diào)整，選用最適濃度測量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實(shí)驗所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。利用方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，用最小顯著極差法(LSD)分析不同溫度脅迫下同一時間大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”酶活性的差異，以及同一溫度脅迫下不同時間大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”酶活性的差異。用Origin 8.6 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”存活率的影響

大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”在不同的溫度脅迫下表現(xiàn)出不同的存活率(圖1)。其中31 ℃組在整個實(shí)驗過程中均未出現(xiàn)死亡，34 ℃組在實(shí)驗24 h出現(xiàn)個體死亡，死亡率為3.33%，48 h存活率為93.33%。而37 ℃組，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”在6 h就出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，實(shí)驗結(jié)束時大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的存活率僅為50%。

圖1 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”存活率的影響Fig.1 Effect of acute temperature stress on survival rate of M.salmoides “Youlu No.3”

2.2 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟抗氧化酶活性的影響

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力變化見圖2。31 ℃和34 ℃實(shí)驗組T-SOD活力呈先升高再下降再升高的變化趨勢，31 ℃組在1 h達(dá)到第一個峰值(309.86 U/mgprot)后隨之下降，3 h時與對照組無顯著性差異，在6 h又開始上升并在48 h時達(dá)到最高值(421.58 U/mgprot)，顯著高于其他時間點(diǎn)；34 ℃組在3 h達(dá)到第一個峰值(299.25 U/mgprot)后隨之下降，12 h顯著低于對照組，24 h又開始上升，48 h顯著高于對照組。37 ℃組實(shí)驗組T-SOD活力呈先升高再下降的變化趨勢，在1 h達(dá)到峰值(298.26 U/mgprot)后隨之下降，在24 h與對照組無顯著性差異。

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中過氧化氫酶(CAT)活力變化見圖3。各組CAT活力均呈先升高再下降的變化趨勢，且均在3 h達(dá)到最高值，分別為108.80、115.95、109.36 U/mgprot，顯著高于其他時間點(diǎn)(31 ℃組6 h組除外)。31 ℃和34 ℃實(shí)驗組CAT活力在48 h仍顯著高于對照組，37 ℃實(shí)驗組在24 h與對照組無顯著差異。31 ℃和34 ℃實(shí)驗組CAT活力在1-48 h內(nèi)均顯著高于對照組(34 ℃組48 h除外)。

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力變化見圖4。31 ℃和34 ℃實(shí)驗組GSH-PX活力呈先升高再下降再升高的變化趨勢，31 ℃組在3 h達(dá)到第一個峰值(82.93 U/mgprot)后隨之下降，在24 h又開始上升并在48 h時達(dá)到最高值(108.41 U/mgprot)，顯著高于其他時間點(diǎn)；34 ℃組在6 h達(dá)到第一個峰值(85.69 U/mgprot)后隨之下降，在24 h與對照組無顯著差異，在48 h回升且顯著高于對照組。37 ℃實(shí)驗組GSH-PX活力呈先升高再下降的變化趨勢，在6 h達(dá)到峰值(90.02 U/mgprot)后隨之下降，在48 h與對照組無顯著性差異。

圖2 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟T-SOD活性的影響Fig.2 Effect of acute temperature stress on T-SOD activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”圖柱上方不同大寫字母表示同一實(shí)驗組不同時間的差異顯著( P<0.05)，不同小寫字母表示同一時間段內(nèi)不同實(shí)驗組之間差異顯著(P<0.05)，下同。

圖3 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟CAT活性的影響Fig.3 Effect of acute temperature stress on CAT activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

2.3 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟溶菌酶(LZM)活力變化見圖5。各組LZM活力均呈先升高再下降的變化趨勢。31 ℃實(shí)驗組在1 h達(dá)到峰值(117.85 U/mgprot)，顯著高于對照組同時顯著高于其他時間點(diǎn)，之后緩慢下降，直至48 h仍顯著高于對照組。34 ℃實(shí)驗組CAT活力在6 h達(dá)到峰值(111.45 U/mgprot)，之后緩慢下降，48 h與對照組無顯著差異。37 ℃實(shí)驗組在6 h達(dá)到峰值(142.35 U/mgprot)后迅速下降至24 h與對照組無顯著差異。

圖4 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟GSH-PX活性的影響Fig.4 Effect of acute temperature stress on GSH-PX activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

圖5 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟LZM活性的影響Fig.5 Effect of acute temperature stress on LZM activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中堿性磷酸酶(AKP)活力變化見圖6。31 ℃實(shí)驗組在1 h迅速升高后基本保持不變，均顯著高于對照組。34 ℃和37 ℃實(shí)驗組AKP活力均在1 h達(dá)到峰值(分別為96.65 U/mgprot和80.73 U/mgprot)，之后緩慢下降，34 ℃組顯著高于對照組，37 ℃實(shí)驗組24 h與對照組無顯著差異。

圖6 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟AKP活性的影響Fig.6 Effect of acute temperature stress on AKP activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中酸性磷酸酶(ACP)活力變化見圖7。各組ACP活力均在6 h達(dá)到最高值，分別為84.17、87.93、90.48 U/mgprot，均顯著高于對照組。31 ℃和34 ℃實(shí)驗組在3 h下降至對照組水平，在6 h又升高，且顯著高于對照組，隨后又下降，直至48 h仍顯著高于對照組。34 ℃組24 h與對照組無顯著差異，37 ℃實(shí)驗組12 h與對照組無顯著差異，48 h顯著低于對照組。

圖7 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟ACP活性的影響Fig.7 Effect of acute temperature stress on ACP activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

3 討論

3.1 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”存活率的影響

溫度是影響魚類生存重要的環(huán)境因子之一， 主要對魚類代謝反應(yīng)起控制作用，從而能夠影響魚類的成活率[9-11]。由試驗結(jié)果可知，在急性溫度脅迫下，34 ℃時大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的成活率高達(dá)95%以上，而37 ℃組的成活率已低至50%。由此可見，37 ℃高溫對于大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號”幼魚的生存已經(jīng)構(gòu)成威脅，因此，在培育大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號”魚苗時溫度應(yīng)該保持在34 ℃以下，否則會造成稚、幼魚的大量死亡。當(dāng)溫度高于22 ℃后，異齒裂腹魚(Schizothoraxoconnori)幼魚存活率顯著降低，當(dāng)溫度為32 ℃時，存活率為0[11]；太平洋鱈(Gadusmicrocephalus)15 ℃高溫脅迫下的成活率僅為43.3%[12]。因此，在大規(guī)模健康養(yǎng)殖中應(yīng)時刻注意由于高溫天氣導(dǎo)致的魚類死亡而帶來的經(jīng)濟(jì)損失，在夏季連續(xù)高溫等極端天氣來臨之前應(yīng)做好相應(yīng)的防護(hù)措施，例如配備能夠迅速降溫的制冷系統(tǒng)等。

3.2 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號” 抗氧化性相關(guān)指標(biāo)的影響

魚類在正常生理代謝中會產(chǎn)生有害的氧化自由基，但是魚體內(nèi)一般都存在清除自由基的抗氧化體系，使自由基處于一個正常水平，維持魚體內(nèi)正常的代謝活動[13]。但是當(dāng)生物受到環(huán)境因子脅迫時，生物體就會產(chǎn)生過量的活性氧和氧自由基，打破生物體內(nèi)活性氧代謝的平衡，如不及時消除就會造成生物體活性氧傷害。SOD作為生物防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，可以消除過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子等過量的自由基，同時CAT將SOD與自由基反應(yīng)生成的 H2O2轉(zhuǎn)化為水，去除體內(nèi)H2O2，保護(hù)細(xì)胞免受H2O2毒性，此外，GSH-PX可以特異性地催化GSH和H2O2的還原，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[14]。因此，SOD、CAT、GSH-PX等一些抗氧化酶通過協(xié)同作用共同清除生物體內(nèi)的氧自由基，從而維持機(jī)體正常代謝，可以作為判斷生物體健康狀況及其抗氧化防御能力的重要指標(biāo)[12]。在本研究中，隨著溫度的升高和脅迫時間的增加，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的T-SOD 、CAT、GSH-PX酶活性迅速升高，且顯著高于對照組，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在溫度脅迫后的軍曹魚(Rachycentroncanadum)[15]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)[16]、太平洋鱈(Gadusmicrocephalus)[12]等，這可能是因為在脅迫初期，魚體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，各種抗氧化酶的活性被激發(fā)增強(qiáng)以清除過量的自由基，并通過適應(yīng)性調(diào)節(jié)相關(guān)生理活動使得機(jī)體維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，說明這三種酶在魚類應(yīng)對高溫脅迫中發(fā)揮了作用[17]。不同的是，在31 ℃、34 ℃、37 ℃溫度脅迫下，大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號”的T-SOD酶活性分別在1 h、3 h、1 h達(dá)到第一個峰值，而CAT酶活性則均是在3 h達(dá)到峰值，GSH-PX酶活性分別在3 h、6 h、6 h達(dá)到第一個峰值，表明與總超氧化物歧化酶相比，過氧化氫酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶酶活性的變化有明顯的滯后性，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在溫度脅迫后的太平洋鱈[12]中，這說明魚類的總超氧化物歧化酶酶活性較過氧化氫酶更易受環(huán)境因子的影響。另外，在31 ℃和34 ℃溫度脅迫后期，T-SOD和GSH-PX酶活性均有不同程度的回升，尤其31 ℃實(shí)驗組更是在48 h達(dá)到最大值，原因可能是較低程度的增溫，機(jī)體有能力清除由于應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基，并保持較高的酶活性來適應(yīng)環(huán)境的變化以保持體內(nèi)平衡，存在抗熱鍛煉的可能性[5,18]，是一種積極的調(diào)節(jié)活動。

3.3 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

LZM是生物體吞噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶，具有防御和免疫調(diào)節(jié)等生理作用[19]，而AKP 和ACP是兩種非特異性磷酸水解酶，能催化磷酸單酯的水解，打開磷酸酯鍵，釋放磷酸離子，促使磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而廣泛參與調(diào)節(jié)生物體生長代謝、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及維持機(jī)體健康，且其功能作用會受到營養(yǎng)狀況、疾病及環(huán)境變化的影響[20,21]。當(dāng)魚體的免疫水平發(fā)生變化時，它們也會產(chǎn)生相應(yīng)的變化，因此它們可以作為水產(chǎn)動物在環(huán)境脅迫下反映非特異性免疫功能的指標(biāo)。本實(shí)驗結(jié)果表明在溫度脅迫后初期，大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號” LZM、AKP和ACP活力均有不同程度的上升趨勢，且顯著高于對照組，產(chǎn)生此現(xiàn)象原因可能是在脅迫初期魚體受到應(yīng)激導(dǎo)致分泌水解酶的能力增強(qiáng)，使之濃度升高，活力增強(qiáng)。這與高溫脅迫后吉富品系尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[22]、銀鯧(Pampusargenteus)[21]相關(guān)免疫酶活變化研究的結(jié)果相似。值得注意的是，在31 ℃和34 ℃脅迫過程中相關(guān)免疫酶活顯著高于對照組，表明與25 ℃比較而言，31 ℃和34 ℃下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”具有更高的生理代謝和免疫水平，適當(dāng)增加水溫可以保證魚體的免疫能力的充分發(fā)揮，減少疾病的發(fā)生。同樣的，吉富品系尼羅羅非魚[22]在31 ℃水溫中的AKP和LZM活力顯著高于25 ℃，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)在27 ℃水溫中的AKP活力顯著高于24 ℃。此類相似的結(jié)果也在大比目魚(Hippoglossushippoglossus)[23]、大西洋鯛(Sparusaurata)[24]等魚中獲得。但37 ℃脅迫后 AKP和ACP活力均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，且在實(shí)驗結(jié)束時低于對照組，這可能是37 ℃的高溫造成一種不可逆轉(zhuǎn)的熱應(yīng)激，從而使其代謝水平下降，表現(xiàn)為水解酶AKP 和ACP活性的降低，這與37 ℃脅迫后大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”死亡率的結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，37 ℃已經(jīng)成為大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的致死溫度，在日常養(yǎng)殖生產(chǎn)中，需要密切關(guān)注池塘溫度的變化，減少溫度應(yīng)激，增加魚體免疫力，提高抗病害能力。同時做好應(yīng)對高溫天氣的防護(hù)措施。