邢晟，梁翠榮，鞏麗萍，石峰，吳秀蕓，王祿山

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室<微生物技術(shù)研究院>，，山東 青島 266237)

胃蛋白酶于1836年由泰奧多爾·施旺(Theodor Schwann)發(fā)現(xiàn)，是一種療效確切的助消化藥，中國、美國、歐洲等藥典均有收載。臨床用于因食蛋白性食物過多所致消化不良、病后恢復(fù)期消化功能減退以及慢性萎縮性胃炎、胃癌、惡性貧血而導(dǎo)致的胃蛋白酶缺乏等癥。根據(jù)《中國藥典》2015年版(二部)[1]，胃蛋白酶提取自豬、羊或牛的胃黏膜，每克胃蛋白酶中含蛋白酶活力不得少于3 800單位。胃蛋白酶在胃酸參與下將蛋白質(zhì)分解成蛋白胨及少量多肽，主要用于消化不良、食欲缺乏等[2-3]。

目前對(duì)胃蛋白酶功效評(píng)價(jià)的主要方法為《中國藥典》2015年版中的效價(jià)測(cè)定方法[4]，另外常采用的方法有福林酚法等[5-6]。這些方法均通過紫外-可見分光光度法測(cè)定底物與酶反應(yīng)過程中底物量的減少或產(chǎn)物量的增加直接或間接表征酶的活性。然而，該方法無法檢測(cè)樣品中胃蛋白酶的實(shí)際含量，無法反映胃蛋白酶的比酶活，因此可能引入低質(zhì)量胃蛋白酶(比活力低，雜蛋白多)投料的風(fēng)險(xiǎn)。如何快速直觀的同時(shí)針對(duì)酶活性及比酶活兩個(gè)指標(biāo)開展酶的功效評(píng)價(jià)是目前技術(shù)發(fā)展的主要需求。明膠-SDS-聚丙烯酰胺凝膠(gelatin-SDS-PAGE)的蛋白酶活性分析方法可直接在電泳膠上準(zhǔn)確地鑒定出具有蛋白酶活性的蛋白帶，從而了解其特性。此法具有靈敏度高、結(jié)果直觀、檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)，因而得到廣泛的應(yīng)用，并不斷被改進(jìn)[7-8]。然而，該方法目前僅能對(duì)具有蛋白酶活性的成分進(jìn)行定性分析，而無法定量，同時(shí)該方法通過復(fù)性電泳展示蛋白酶活性，在一定程度上影響了酶的原始活性狀態(tài)，不能相對(duì)客觀地反映樣品中酶的實(shí)際功效狀態(tài)，為此，我們采用光密度分析方法，結(jié)合活性電泳技術(shù)對(duì)這一方法進(jìn)行了改進(jìn)，并針對(duì)胃蛋白酶開展了相關(guān)分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 儀器：Bio-Rad Mini-Protean Tetra Cell電泳槽；Bio-Rad Power PacTM Basic電泳儀；1.0 mm玻璃板；離心機(jī)；恒溫培養(yǎng)箱；脫色搖床等。

對(duì)照品：胃蛋白酶(批號(hào)：SLBQ3760V，分子量35kDa)，購自Sigma公司；血清白蛋白(牛)(來源：中檢院，批號(hào)：140619-201622，蛋白含量：23.5 mg/瓶)；蛋白質(zhì)MarkerⅣ(14.4～116 kDa，批號(hào)：C600525，上海生工公司)。試劑：水為Millipore Q-POD制備的純化水，其他試劑均為分析純。樣品：4個(gè)生產(chǎn)廠家的胃蛋白酶原料。

1.2 樣品溶液制備 選取胃蛋白酶生產(chǎn)企業(yè)提供的4份原料藥，分別命名為YL1～YL4。

原料溶液制備：精密稱取原料50 mg，置100 mL量瓶中，加入pH 3.0磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，制成含胃蛋白酶0.5 mg·mL-1的溶液，渦旋震蕩使混勻，置4 ℃冰箱中冷藏待用(當(dāng)日使用)。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別取Sigma胃蛋白酶適量，置于10 mL量瓶中，加入pH 3.0磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，制成含胃蛋白酶0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·mL-1的溶液備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 常規(guī)法比酶活測(cè)定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照《中國藥典》2015年版(四部)通則0731蛋白質(zhì)含量測(cè)定第二法福林酚法(Lowry法)。胃蛋白酶效價(jià)測(cè)定參照《中國藥典》2015年版(二部)胃蛋白酶項(xiàng)下的效價(jià)測(cè)定方法。測(cè)得的效價(jià)結(jié)果與蛋白質(zhì)含量結(jié)果的比值即為比酶活(IU·mg-1)。

2.2 SDS-PAGE 試驗(yàn)過程參考SDS-PAGE經(jīng)典方法[9]，其中分離膠配方(10 mL 10%)：40% 聚丙烯酰胺貯液2.5 mL，1.5 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH 8.8)2.5 mL，10% 過硫酸銨 0.1 mL，10% SDS 0.1 mL，四甲基乙二胺(TEMED)10 μL，補(bǔ)水至10 mL。濃縮膠配方(5 mL 5%)：40% 聚丙烯酰胺貯液0.625 mL，1.0 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH 6.8)0.63 mL，10% 過硫酸銨 0.05 mL，10% SDS 0.05 mL，四甲基乙二胺(TEMED)5 μL，補(bǔ)水至5 mL。樣品與5×上樣緩沖液(每10 mL含0.6 mL 0.5 mol·L-1pH 6.8 Tris-HCl；5 mL 50%甘油；1 mL 1%溴酚藍(lán)；0.5 mL β-巰基乙醇；1 mL 10% SDS；1.9 mL蒸餾水)按4∶1比例混合均勻。上樣10 μL，起始電壓60 V，待樣品中的溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后調(diào)電壓至120 V，電泳結(jié)束后使用1%考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色，之后使用脫色液(乙酸-乙醇-水=1∶1∶8)脫色，進(jìn)行圖像掃描處理。

2.3 Native-PAGE 試驗(yàn)過程參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[10]，樣品與5×上樣緩沖液(每10 mL含0.6 mL 0.5 mol·L-1pH 6.8 Tris-HCl；5 mL 50%甘油；1 mL 1%溴酚藍(lán)；3.4 mL蒸餾水)按4∶1比例混合均勻。上樣10 μL。電泳分離膠濃度均為10%。電泳全程4 ℃冰浴，起始電壓60 V，待樣品中的溴酚藍(lán)前沿跑入分離膠后調(diào)電壓至120 V，電泳結(jié)束后使用1%考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色，之后使用脫色液(乙酸-乙醇-水=1∶1∶8)脫色，進(jìn)行圖像掃描處理。

2.4 蛋白酶電泳 樣品中的蛋白質(zhì)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得到分離，整個(gè)電泳過程在冰浴條件下進(jìn)行，樣品中的蛋白酶活性得以完整保留。電泳結(jié)束后，用pH 3.0磷酸鹽緩沖液漂洗2次，除掉凝膠表面的雜質(zhì)，每次5 min，再置于預(yù)先于40 ℃恒溫水浴保溫的1%酪蛋白的pH 3.0磷酸鹽緩沖液中，輕微振搖使凝膠完全浸入，40 ℃恒溫2 h，用pH 3.0磷酸鹽緩沖液漂洗2次，1%考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色20 min后脫色。將凝膠掃描形成TIF格式圖像，分辨率300 dpi。

在這一過程中，具有一定粒徑的酪蛋白分子進(jìn)入凝膠，在酶促反應(yīng)溫度下，凝膠中的胃蛋白酶將進(jìn)入的酪蛋白分子水解，反應(yīng)結(jié)束后，通過考馬斯亮藍(lán)染色液使殘留在凝膠中的酪蛋白染色，脫色后，背景中胃蛋白酶水解圈的光密度值與蛋白酶效價(jià)成正比。胃蛋白酶條帶的光密度值與蛋白質(zhì)含量成正比，測(cè)得的效價(jià)結(jié)果與蛋白質(zhì)含量結(jié)果的比值即為比酶活。通過與確定比酶活的對(duì)照品(Sigma)比較，最終確定供試品的比酶活(IU·mg-1)。

2.5 光密度分析 數(shù)字化與定量分析的關(guān)鍵是數(shù)據(jù)提取和有效分析處理[11]。具體處理過程如下：對(duì)經(jīng)過掃描的電泳凝膠圖像進(jìn)行簡單泳道標(biāo)記后，切去濃縮膠部分，將圖像轉(zhuǎn)換為光密度圖像。不同試驗(yàn)批次的凝膠存在的微小差異可通過質(zhì)控泳道經(jīng)Image J進(jìn)行均一化處理，主要處理內(nèi)容包括圖像尺寸統(tǒng)一，以質(zhì)控泳道為依據(jù)的光密度校正等。之后對(duì)圖像中的電泳條帶進(jìn)行光密度數(shù)據(jù)的提取和分析，最后進(jìn)行相關(guān)的計(jì)算和分析統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)提取和分析過程使用的軟件主要包括：①Photoshop： Adobe公司推出的大型圖像處理軟件，主要用于圖像的處理和優(yōu)化；②Image J：基于Java的圖像處理軟件，由National Institutes of Health開發(fā)(https://imagej.nih.gov/ij/)。

3 結(jié)果

3.1 光密度方法驗(yàn)證 為驗(yàn)證電泳圖像光密度數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)濃度的相關(guān)性，取“1.2”項(xiàng)下的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液電泳并進(jìn)行數(shù)據(jù)提取分析，電泳結(jié)果如圖1所示。

按照“2.5”項(xiàng)下操作方法對(duì)電泳光密度數(shù)據(jù)進(jìn)行提取校正(0.01 mg·mL-1對(duì)應(yīng)泳道1濃度過低，無有效提取信息，根據(jù)上樣量計(jì)算約為80 ng)，提取數(shù)據(jù)如表1。

表1 胃蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)工作液電泳圖光密度提取值

對(duì)提取數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖2所示。如圖所示，胃蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)工作液電泳所對(duì)應(yīng)的光密度與樣品蛋白質(zhì)濃度成良好的線性關(guān)系，采用光密度分析方法可行。

3.2 藥典方法測(cè)定原料比酶活 按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 藥典方法測(cè)定比酶活

測(cè)定結(jié)果顯示，4批胃蛋白酶原料的蛋白質(zhì)含量均在70%以上，其中YL4蛋白質(zhì)含量較高，達(dá)80.9%。4批胃蛋白酶原料比酶活在11～14 IU·mg-1之間，YL3最高，達(dá)13.6 IU·mg-1?，F(xiàn)有藥典方法無法準(zhǔn)確測(cè)定原料的純度。

3.3 光密度法測(cè)定原料比酶活及純度 取4批胃蛋白酶原料適量，溶于pH 3.0磷酸鹽緩沖液中，制成含胃蛋白酶0.5 mg·mL-1的溶液，渦旋震蕩使混勻，按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3所示。

由圖中可見，除胃蛋白酶條帶外，不同原料中均存在一定量的其他雜質(zhì)蛋白質(zhì)，對(duì)胃蛋白酶以及其他雜質(zhì)蛋白的光密度數(shù)據(jù)提取后進(jìn)行胃蛋白酶純度分析，結(jié)果見表3。

原料中胃蛋白酶含量占總蛋白質(zhì)含量的比例均在75.0%～85.0%之間，其中YL3和YL4中胃蛋白酶純度較高。結(jié)合常規(guī)方法測(cè)定的胃蛋白酶原料蛋白含量，4批胃蛋白酶原料實(shí)際含胃蛋白酶比例見表4。

表3 胃蛋白酶原料純度

表4 原料實(shí)際含胃蛋白酶量

綜合結(jié)果，YL4中實(shí)際含有胃蛋白酶比例最高，達(dá)68.42%，YL2中實(shí)際含有胃蛋白酶比例最低，為55.49%，原料中實(shí)際含胃蛋白酶濃度將影響廠家投料量及產(chǎn)品雜質(zhì)含量。

為分析原料中實(shí)際活性成分的比例，采用蛋白酶電泳法進(jìn)行比酶活分析，結(jié)果見圖4。

由圖4可以清晰地看到胃蛋白酶條帶周邊有明顯的水解圈，對(duì)胃蛋白酶以及水解圈的光密度值進(jìn)行提取，并與Sigma標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果比較即可測(cè)定不同原料的比活力(經(jīng)測(cè)定，Sigma胃蛋白酶比活為149 IU·mg-1)，具體結(jié)果見表5。

結(jié)果顯示YL4比酶活最高，為35.22 IU·mg-1，通過常規(guī)方法測(cè)定的結(jié)果中，YL4的比酶活同樣是最高的，但數(shù)值只有13.6 IU·mg-1，兩者相差一倍多，這是因?yàn)橥ㄟ^光密度法測(cè)定的比酶活反映的是原料中實(shí)際效價(jià)與總胃蛋白酶的比值，藥典方法測(cè)定的比酶活是實(shí)際效價(jià)與總蛋白質(zhì)(包含胃蛋白酶和其他雜質(zhì)蛋白)的比值。另外，原料中可能存在的酚類以及糖類對(duì)福林酚法的影響會(huì)進(jìn)一步降低藥典方法的測(cè)定結(jié)果，進(jìn)而增加兩種方法的差距?？梢姽饷芏确ㄏ鄬?duì)藥典方法，更加準(zhǔn)確，專屬性更強(qiáng)。

表5 胃蛋白酶原料比酶活

注：胃蛋白酶含量(mg)=胃蛋白酶光密度/(Sigma光密度/Sigma濃度);實(shí)際效價(jià)(IU)=水解圈光密度/(Sigma水解圈光密度/Sigma實(shí)際效價(jià))

4 討論

本文建立的蛋白酶電泳方法，在完整保留功能蛋白質(zhì)活性的基礎(chǔ)上，通過改良處理方式及分析方法，定量分析酶組分的變化。為最大限度地保持樣品活性，采用的Native-PAGE過程必須在冰浴中進(jìn)行。為確保試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，嚴(yán)格控制酶促反應(yīng)時(shí)間、底物濃度、緩沖液pH值以及染色時(shí)間等試驗(yàn)條件的一致，并且對(duì)圖像進(jìn)行統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化處理。與復(fù)性電泳技術(shù)相比，該方法能夠完全保持樣品中的酶活性，并能夠同時(shí)檢測(cè)具有相同底物降解能力的不同酶組分。檢測(cè)靈敏度高于考馬斯亮藍(lán)R250染色方法，與硝酸銀染色方法的靈敏度相當(dāng)[10]。

與標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果相比較，通過蛋白酶電泳法測(cè)定的效價(jià)結(jié)果反映了樣品中的實(shí)際功效成分，能夠更加直接的反應(yīng)樣品中胃蛋白酶的功效及質(zhì)量，具有較好的應(yīng)用前景。通過調(diào)整電泳方法和染色技術(shù)，該方法可應(yīng)用在包括糖苷酶等可用于醫(yī)藥行業(yè)的酶制劑的分析研究中。