鄧靜 ，馬濤 ，常自偉 ，趙偉靜 ，楊俊 ,＊

1中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所，波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢磁共振中心，武漢 430071

2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

1 引言

蛋白質(zhì)組裝體廣泛存在于生物體內(nèi)，并行使不同的生物學(xué)功能，如有些蛋白質(zhì)組裝體參與組成細菌分泌系統(tǒng)1、病毒衣殼2和細胞骨架細菌素細絲3等，而某些蛋白質(zhì)組裝體存在于病變的生物組織或細胞內(nèi)，參與某些疾病的發(fā)生或發(fā)展，如與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)的淀粉樣蛋白纖維PrP(Prion Protein)4、Aβ (Amyloid beta)5和α-syn (αsynuclein)6等。因此，對于這些組裝體的研究有利于理解其生物學(xué)功能及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，常用的解析蛋白質(zhì)高分辨三維結(jié)構(gòu)的方法包括X射線晶體衍射(X-ray)，核磁共振技術(shù)(包括液體NMR，固體NMR)，和冷凍電鏡(Cryo-EM)等。其中，固體NMR是一種強有力的分析手段，廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)和生物等領(lǐng)域7。在蛋白質(zhì)組裝體的結(jié)構(gòu)解析中，與其它方法相比，固體NMR具有以下獨特優(yōu)勢：(1)蛋白組裝體分子量大，且有些樣品如淀粉樣纖維溶解度很低，無法使用液體NMR技術(shù)進行研究。而固體NMR適用于難溶或不溶的樣品，且信號線寬不受蛋白質(zhì)分子量大小影響，因此擅長于蛋白質(zhì)組裝體的研究；(2)蛋白質(zhì)組裝體難結(jié)晶，限制了X射線晶體方法的應(yīng)用；而固體NMR不需要樣品結(jié)晶，可在更接近生理條件下探測其結(jié)構(gòu)信息；(3)近年來Cryo-EM廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析，它可快速獲得蛋白分子整體輪廓，但要得到高分辨的三維結(jié)構(gòu)仍有一定難度。固體NMR可獲得原子水平的蛋白結(jié)構(gòu)信息，常與Cryo-EM聯(lián)用共同完成對蛋白質(zhì)組裝體的高分辨結(jié)構(gòu)解析。如今固體NMR及其聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)組裝體的結(jié)構(gòu)研究中，成功獲得了一些蛋白質(zhì)組裝體的高分辨結(jié)構(gòu)，如圖1中的生物組裝體結(jié)構(gòu)和圖2中的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)。

固體NMR可以測定蛋白質(zhì)組裝體的二級，三級和四級結(jié)構(gòu)信息，在測定其高分辨結(jié)構(gòu)時一般遵循以下流程：(1)制備蛋白質(zhì)組裝體樣品。(2)完成蛋白質(zhì)氨基酸殘基的化學(xué)位移歸屬?；?3C檢測的固體NMR多維實驗(如三維NCACX，NCOCX和CONCA等)采集得到殘基內(nèi)和殘基間主/側(cè)鏈相關(guān)信號，通過主鏈行走的辦法完成殘基化學(xué)位移歸屬。(3)采集結(jié)構(gòu)約束信息。固體NMR中常利用重耦技術(shù)(包括13C–13C同核重偶和15N–13C異核重偶)得到空間距離接近的原子間相關(guān)信號，對這些信號進行指認(rèn)，得到距離約束信息。此外，固體NMR常聯(lián)合其它實驗技術(shù)(如STEM，X-ray和Cryo-EM等)收集重要的結(jié)構(gòu)輔助信息。(4)蛋白質(zhì)組裝體結(jié)構(gòu)計算與優(yōu)化。以收集到的所有結(jié)構(gòu)約束信息為依據(jù)，利用結(jié)構(gòu)計算軟件如XPLORNIH11、CNS12、CYANA13等對蛋白質(zhì)組裝體高分辨結(jié)構(gòu)進行計算與優(yōu)化。

圖1 固體NMR解析的生物組裝體的高分辨結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Examples of biological assemblies that have resulted in high resolution structures by solid-state NMR data.

圖2 固體NMR解析的淀粉樣蛋白纖維高分辨結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Examples of amyloid protein fibrils that have resulted in high resolution structures by solid-state NMR data.

在過去近十年中，通過固體NMR解析生物大分子結(jié)構(gòu)的數(shù)量顯著增加，在這些結(jié)構(gòu)中，大約30%屬于蛋白質(zhì)組裝體18，表明固體NMR在蛋白質(zhì)組裝體的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。在固體NMR對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析中，關(guān)鍵步驟是收集距離約束條件，距離約束條件的數(shù)量和質(zhì)量決定了最終三維結(jié)構(gòu)的質(zhì)量。而良好的譜圖分辨率是獲得距離約束條件的重要因素，因此提高譜圖分辨率是解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的重要前提。本文介紹了固體NMR中改善譜圖分辨率和收集蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)約束條件的常用方法，以及固體NMR與其它技術(shù)的聯(lián)用解析蛋白質(zhì)組裝體的方法，并以Aβ淀粉樣蛋白纖維和T3SS針狀體結(jié)構(gòu)解析為例介紹固體NMR在蛋白質(zhì)組裝體結(jié)構(gòu)解析方面的進展。

2 利用固體NMR技術(shù)獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)約束信息

2.1 改善譜圖質(zhì)量的方法

信噪比和分辨率是評價譜圖質(zhì)量的兩大要素。高信噪比一般通過13C/15N同位素標(biāo)記和提高樣品量的方法獲得。譜圖分辨率一般以信號線寬(即半高寬)作為評判標(biāo)準(zhǔn)。影響信號線寬的因素包括均勻增寬和非均勻增寬。粗略地講，均勻增寬是指每個核對線寬的貢獻都相同，非均勻增寬中每個核對線寬的貢獻不同，影響因素包括同核偶極-偶極耦合，異核偶極-偶極耦合和化學(xué)位移各向異性等。在固體NMR中蛋白樣品運動受限，不能如溶液狀態(tài)一樣通過自身快速翻轉(zhuǎn)平均偶極-偶極耦合和化學(xué)位移各向異性，故而信號線寬增寬嚴(yán)重?？焖倌Ы切D(zhuǎn)(MAS)可有效壓制偶極-偶極耦合和化學(xué)位移各向異性作用，大大提高譜圖的分辨率。為了進一步提高譜圖質(zhì)量，在樣品制備和同位素標(biāo)記方法上進行了不遺余力的探索，為結(jié)構(gòu)距離約束的采集奠定基礎(chǔ)。

2.1.1 優(yōu)化樣品制備方法

蛋白質(zhì)構(gòu)象不均一會引起譜線的非均勻增寬，在固體NMR中是影響譜圖分辨率的主要因素。在蛋白質(zhì)纖維樣品的研究中發(fā)現(xiàn)，改變制備樣品的條件就可能得到不同構(gòu)象的纖維?？赏ㄟ^優(yōu)化纖維孵育時間，攪動速度，溫度，pH，蛋白濃度，緩沖液性質(zhì)和其它物質(zhì)(如金屬離子、磷脂膜19、螯合劑、氧化還原劑、抗菌分子等)的存在與數(shù)量等來提高樣品的構(gòu)象均一性。樣品的水合程度也會影響譜圖分辨率，因此蛋白樣品裝入轉(zhuǎn)子時的狀態(tài)(水合還是凍干，以及含水量)也需要優(yōu)化。

2.1.2 優(yōu)化樣品同位素標(biāo)記方法

同位素標(biāo)記的蛋白樣品可以通過化學(xué)合成或生物表達的方式獲得，而對于一般蛋白樣品，通過基因重組表達(大腸桿菌，酵母或其它真核細胞)是獲得15N/13C標(biāo)記蛋白樣品的有效方法。標(biāo)記方法包括均勻全標(biāo)記(uniform labeling)，稀疏標(biāo)記(sparse labeling)和選擇性標(biāo)記(selective labeling)等。均勻全標(biāo)記樣品譜峰重疊嚴(yán)重，且存在很強的偶極截短效應(yīng)20。偶極截短效應(yīng)是指當(dāng)周圍標(biāo)記的原子數(shù)目多時，鄰近的原子的偶極耦合占主導(dǎo)作用，信號不能實現(xiàn)較遠距離傳遞，不利于長程距離約束的獲得。稀疏標(biāo)記方法利用特殊13C源選擇性的標(biāo)記某些原子，如1-13C葡萄糖碳源表達的蛋白質(zhì)傾向標(biāo)記絲氨酸和丙氨酸Cβ，而2-13C葡萄糖碳源傾向標(biāo)記絲氨酸和丙氨酸Cα。這種方法有效的降低了偶極截短效應(yīng)，同時與均勻標(biāo)記相比，信號線寬明顯下降，因此可以大大提高譜圖分辨率。此外選擇性標(biāo)記可特異性的標(biāo)記某類氨基酸，甚至是某個原子，實現(xiàn)特定位點的信息采集。

2.1.3 其它方法

通過改善實驗條件和實驗方法也可以提高譜圖的質(zhì)量，如采用更高磁場的譜儀(高達1 GHz)，不斷優(yōu)化的極化轉(zhuǎn)移技術(shù)21，采用超快速MAS探頭22以及高轉(zhuǎn)速下的1H檢測實驗方法23對信號的靈敏度和譜圖分辨率都有很大改善。我們課題組提出了新的脈沖序列，可增強脂肪族13C/13C同核間24和13C/15N異核間25極化轉(zhuǎn)移效率，提高信號強度，節(jié)省固體NMR多維實驗的時間。

2.2 提取結(jié)構(gòu)約束的方法

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)量依賴于結(jié)構(gòu)約束的數(shù)目和質(zhì)量。結(jié)構(gòu)約束條件主要包括角度約束和距離約束，距離約束又分為單體內(nèi)(或分子內(nèi))和單體間(或分子間)的距離約束。這些結(jié)構(gòu)約束可確定蛋白質(zhì)單體折疊方式以及單體堆疊的界面信息。本節(jié)主要介紹固體NMR獲取結(jié)構(gòu)約束條件的常用方法和一些新的技術(shù)手段。

2.2.1 角度約束

蛋白質(zhì)的主鏈扭轉(zhuǎn)角信息(如φ/Ψ二面角)作為結(jié)構(gòu)計算中重要的角度約束，可通過TALOS+26利用氨基酸的13Cα，13Cβ，13C’和15N的化學(xué)位移預(yù)測得到。此外根據(jù)相關(guān)公式27計算其二級化學(xué)位移可推斷殘基片段的二級結(jié)構(gòu)類型(如α-螺旋，β-折疊或無規(guī)結(jié)構(gòu))。

2.2.2 距離約束

距離約束對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析至關(guān)重要，尤其是長程距離約束，涉及的實驗方法有13C-13C相關(guān)的PDSD28、DARR29、PAR30等，13C-15N相關(guān)的REDOR，TEDOR31等，以及1H-1H相關(guān)的NHHC，CHHC實驗32，可采集到空間距離鄰近的13C/13C原子間或13C/15N間的相關(guān)信號，即為距離約束。改變混合時間可以控制信號傳遞的距離范圍，在不考慮弛豫時，混合時間越長，信號傳遞的越遠，越有利于建立長程耦合。但是，CHHC/NHHC、PAR/TEDOR和PDSD/DARR的混合時間通常分別小于1.0、20和500 ms。這是因為過長的混合時間既使信號因弛豫而衰減，也使信號因傳至更多自旋而分散，反而不利于獲取長程相關(guān)信息。相關(guān)信號一般分為四類：(1)殘基內(nèi)13C-13C的相關(guān)，即所有相關(guān)信號來自同一個殘基；(2)短程相關(guān)，來自殘基i與(i ± 1) –(i ± 2)的相關(guān)；(3)中程相關(guān)，包括從殘基i與(i ± 2)–(i ± 4)的相關(guān)性。(4)長程相關(guān)/遠程相關(guān)，包含殘基i與> (i + 4)的相關(guān)，較多出現(xiàn)在長混合時間譜中(如600M譜儀中混合時間300–500 ms等)。長程相關(guān)的殘基在一級序列中距離較遠，但空間距離較近(約1–9 ?)，這對于蛋白折疊方式的確認(rèn)十分重要。

在實際譜圖分析中，很多信號歸屬不明確，即模糊約束(ambiguous restraints)，歸屬的不確定性主要源于兩方面：譜圖分辨率很差，信號重疊無法區(qū)分；單體內(nèi)殘基與單體間殘基相關(guān)信號同時出現(xiàn)，難以區(qū)分。譜圖的分辨率和信號重疊可以通過優(yōu)化樣品制備或標(biāo)記方法進行改善，而對于單體內(nèi)與單體間殘基信號的區(qū)分，則通過設(shè)計同位素的標(biāo)記方式進行區(qū)分，詳細內(nèi)容見章節(jié)4.1，圖3b。

2.2.3 其它獲得距離約束的方法

氫檢測技術(shù)近年來得到快速發(fā)展，在固體NMR中的應(yīng)用逐漸成熟。由于1H比13C原子具有更高的旋磁比(約是13C原子的4倍)，同時1H具有幾乎100%的天然豐度，且在蛋白質(zhì)中含量高分布廣，因此1H非常適用于蛋白長程距離約束測定。目前，高磁場核磁譜儀的應(yīng)用，快速MAS技術(shù)的發(fā)展和樣品氘代方法的設(shè)計都極大促進了氫檢測技術(shù)在固體NMR中的發(fā)展33。氫檢測技術(shù)提高了譜圖分辨率和靈敏度，減少了蛋白質(zhì)樣品用量和實驗時間，得到豐富的結(jié)構(gòu)約束條件，在生物大分子的結(jié)構(gòu)解析中具有強大潛力。

順磁標(biāo)記技術(shù)是基于未成對電子與自旋核之間的偶極–偶極相互作用而建立起來的技術(shù)。未成對電子自旋可以產(chǎn)生磁場，且電子的旋磁比高于自旋核～2–3個數(shù)量級，因此自由電子對與自旋核間具有很強的偶極-偶極耦合作用。這種相互作用的輻射范圍最遠可達20–24 ?，遠大于傳統(tǒng)的自旋核間相互作用的距離上限(約為9 ?)。在固體NMR中引入順磁標(biāo)記技術(shù)可獲得更為豐富的距離約束條件。Sengupta等34利用順磁馳豫增強(PRE，Paramagnetic relaxation enhancement)技術(shù)，引入Cu2+順磁探針在固體NMR中得到豐富的距離約束信息。此外我們課題組35結(jié)合贗接觸位移技術(shù)(PCS，Pseudocontact shift)和Rosetta方法，通過引入的磁各向異性順磁金屬離子獲得了固體NMR的PCS數(shù)據(jù)，并計算得到GB1蛋白的高分辨三維結(jié)構(gòu)。因此，利用順磁標(biāo)記技術(shù)可以為固體NMR解析蛋白結(jié)構(gòu)提供新思路。

圖3 Aβ42纖維結(jié)構(gòu)解析相關(guān)的距離約束Fig. 3 The structure restraints determining the Aβ42 fibril structure.

3 固體NMR聯(lián)合其它技術(shù)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

近年來，固體NMR與其它研究手段的聯(lián)用得到快速發(fā)展。這些研究手段包括X-ray晶體衍射，STEM，Cryo-EM等實驗技術(shù)以及CS-Rosetta和分子動力學(xué)(MD，molecular dynamics)模擬等結(jié)構(gòu)預(yù)測和模擬手段。X-ray晶體衍射常見于晶體樣品的結(jié)構(gòu)解析，也應(yīng)用于一些結(jié)晶淀粉樣蛋白中，揭示了其交叉β折疊的結(jié)構(gòu)特性，且發(fā)現(xiàn)其β片層間的距離約為4.7 ?，后證明該特性廣泛存在于淀粉樣纖維中36。故在淀粉樣蛋白中，固體NMR常結(jié)合X-ray晶體衍射的結(jié)論共同描述其三維結(jié)構(gòu)37。STEM可提供蛋白質(zhì)組裝體的MPL數(shù)據(jù)，有助于確認(rèn)單體堆積方式38，詳細過程見章節(jié)4.1。MD利用分子的力場約束和能量約束來演示分子運動，尤其在描述瞬態(tài)結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)中間態(tài)發(fā)揮著重要作用，常與固體NMR技術(shù)聯(lián)用確認(rèn)蛋白的結(jié)構(gòu)模型以及其動力學(xué)信息39。

氨基酸的化學(xué)位移中包含了豐富的蛋白質(zhì)構(gòu)象信息。Rosetta等40是一種結(jié)合化學(xué)位移數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的軟件。Rosetta把目標(biāo)蛋白質(zhì)序列分為若干個片段，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中搜索序列相似的結(jié)構(gòu)，并加入實驗所得的化學(xué)位移數(shù)據(jù)對所選結(jié)構(gòu)進行篩選，提高所選結(jié)構(gòu)的可信度。Rosetta結(jié)合PDB中的結(jié)構(gòu)信息與實驗數(shù)據(jù)對目標(biāo)蛋白進行模擬，可快速獲得與實驗條件更為接近的結(jié)構(gòu)模型或高分辨結(jié)構(gòu)。如在細菌衣殼蛋白M138的結(jié)構(gòu)確認(rèn)中，基于明確的固體NMR距離約束利用Rosetta得到一個結(jié)構(gòu)模型，在該結(jié)構(gòu)模型基礎(chǔ)上對模糊的距離約束進行歸屬，最后得到高分辨結(jié)構(gòu)(RMSD為0.47 ?)。

Cryo-EM是近年來熱門的蛋白結(jié)構(gòu)解析手段，固體NMR與Cryo-EM聯(lián)用技術(shù)逐漸廣泛地應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)組裝體的結(jié)構(gòu)解析。最具有代表性的是T3SS針狀體的高分辨結(jié)構(gòu)41的確認(rèn)，結(jié)合Cryo-EM得到的7.7 ?的密度圖和固體NMR的二面角約束和大量距離約束條件，利用Rosetta將兩套數(shù)據(jù)整合得到了分辨率為0.4 ?的高分辨結(jié)構(gòu)，詳細過程見章節(jié)4.2。這種固體NMR-Cryo-EM的聯(lián)用技術(shù)也被應(yīng)用到淀粉樣纖維的結(jié)構(gòu)解析，如運甲狀腺素蛋白的交聯(lián)淀粉樣蛋白原纖維中，將固體NMR測量的分子內(nèi)距離約束和扭轉(zhuǎn)角約束與Cryo-EM的電子密度圖結(jié)合，解析得到了運甲狀腺素蛋白原纖維的二級，三級和四級結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)提供了分子堆疊的相互作用信息，有助于了解運甲狀腺素蛋白從單體組裝成原絲，再到成熟原纖維的過程42。此外，Jeon等2在對RSV CA的結(jié)構(gòu)研究中，僅利用固體NMR所得的原子位點的扭轉(zhuǎn)角信息與Cryo-EM所得結(jié)構(gòu)結(jié)合，將分辨率從Cryo-EM的24 ?提高到1.5 ?。Cryo-EM擅長表征蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)域的特性，而固體NMR可同時描述剛性和柔性的結(jié)構(gòu)信息。Sborgi等43在ASC炎性體結(jié)構(gòu)的研究中，結(jié)合Cryo-EM的結(jié)構(gòu)信息和固體NMR的扭轉(zhuǎn)角信息以及柔性區(qū)域的結(jié)構(gòu)信息，得到了更高分辨率的結(jié)構(gòu)模型。

4 固體NMR在蛋白質(zhì)組裝體結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用

4.1 Aβ淀粉樣蛋白纖維結(jié)構(gòu)解析

淀粉樣蛋白纖維一般由正常的蛋白質(zhì)異常累積形成，常伴隨著蛋白質(zhì)構(gòu)象錯誤折疊。Aβ淀粉樣蛋白具有神經(jīng)毒性，與阿爾茲海默癥(AD，又名老年癡呆癥)密切相關(guān)。Aβ由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過β-分泌酶和γ-分泌酶兩步切割形成，常見類型有Aβ40和Aβ42。Aβ淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)的解析有助于理解其聚集機制和致病機理。

運用固體NMR方法，Walti等5和Colvin等16先后發(fā)表了Aβ42的高分辨纖維結(jié)構(gòu)，兩個結(jié)構(gòu)顯示出相同的“S”型單體結(jié)構(gòu)特征(如圖2c)，并且單體間的堆疊方式(包括垂直于纖維軸的側(cè)向堆基和平行于纖維軸的軸向排列)也十分類似。通過STEM的暗場圖像分析Aβ42纖維的MPL值，可確認(rèn)單體側(cè)向堆積數(shù)目。MPL定義為每0.47 nm長度的纖維單絲的相對分子質(zhì)量：公式為MPL = M × n ÷0.47，其中M表示蛋白單體相對分子質(zhì)量，n為每個β層的單體數(shù)目，相鄰的β片層間距約為0.47 nm (淀粉樣蛋白纖維的X-ray衍射圖案表明其β層間主鏈間距約為0.47 nm)。其中煙草花葉病毒(TMV)有固定MPL值(131 kDa·nm?1)，常作為內(nèi)標(biāo)用于質(zhì)量校準(zhǔn)。Colvin等16分析表明Aβ42纖維側(cè)向堆積為二聚體形式，如圖3a。

不同標(biāo)記方式可幫助區(qū)分單體內(nèi)/單體間距離約束條件，如圖3b。對于13C/15N均勻(homogeneous)記樣品，同時出現(xiàn)單體內(nèi)和單體間相關(guān)信號，天然豐度稀釋(diluted)樣品(天然豐度：13C/15N標(biāo)記 =3 : 1)中主要出現(xiàn)單體內(nèi)相關(guān)信號，13C :15N = 1 : 1混合(mixed)標(biāo)記樣品其13C-15N相關(guān)信號主要來源分子間相關(guān)。此外Loquet等44利用1-13C葡萄糖和2-13C葡萄糖標(biāo)記的互補性區(qū)分單體內(nèi)/單體間信號。單體內(nèi)距離約束確定Aβ42單體的“S”型結(jié)構(gòu)特征；分子間距離約束如L17Cγ–M35Cβ，Q15Cγ–M35Cβ等則反應(yīng)出側(cè)向排列分子間的界面信息，如圖3c；分子間距離約束如S8Cα–S8Cα，L17Cδ1–L17Cγ，S26Cα–S26Cβ，V40Cγ2–V40Cβ等說明其軸向排列方式為平行對準(zhǔn)方式。

結(jié)合STEM所得的二聚體結(jié)構(gòu)信息和固體NMR所收集的497個距離約束，利用CYANA最終確定Aβ42纖維高分辨結(jié)構(gòu)，主鏈原子的RMSD(Root-mean-square Deviation)為(0.71 ± 0.12) ?，如圖2c所示。

圖4 多種Aβ40纖維結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 4 The various structure models of Aβ40 fibrils.

隨著Aβ42和Aβ40結(jié)構(gòu)研究的報道日益增多，Aβ纖維結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出多態(tài)性。Aβ42的結(jié)構(gòu)中Colvin等16，W?lti等5和Xiao等45都發(fā)現(xiàn)單體內(nèi)K28與C端殘基存在鹽橋，這對結(jié)構(gòu)有重要的穩(wěn)定作用；單體沿纖維軸平行對準(zhǔn)排列，如圖2c。此外Luhrs等15在2005年發(fā)表的Aβ42結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)不同單體的β片層交錯排列，即單體n的β1和單體n?1的β2排列，形成獨特的結(jié)構(gòu)形態(tài)，如圖2b。Aβ40的結(jié)構(gòu)同樣存在多態(tài)性。Petkova等46在2002年發(fā)表的結(jié)構(gòu)中，Aβ40以二聚形式存在，兩單體C端平行排列，如圖4a。Petkova等47在2006年和Bertini等48在2011提出結(jié)構(gòu)中，單體的C端反平行排列，如圖4b。已報道的Osaka突變體(E22Δ)17顯示出獨特的結(jié)構(gòu)特點，如圖2d。Paravastu等49在2008年提出的結(jié)構(gòu)中，Aβ40以三聚體形式存在，如圖4c。此外我們課題組19在2014年提出了Aβ40在磷脂囊泡環(huán)境中形成的纖維結(jié)構(gòu)，與溶液環(huán)境中形成的Aβ40纖維對比，前者纖維疏水內(nèi)核更短，且三維結(jié)構(gòu)也有明顯不同。這些結(jié)構(gòu)差異表明了磷脂膜對Aβ纖維結(jié)構(gòu)的影響，對探索細胞膜環(huán)境中的Aβ淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)具有重要意義。Aβ40結(jié)構(gòu)多態(tài)性是Aβ淀粉樣纖維的內(nèi)在屬性，這些豐富的蛋白結(jié)構(gòu)可幫助我們了解在生理條件下Aβ的蛋白錯誤折疊機理，對理解其在AD疾病中的致病機理具有重要意義。

4.2 T3SS針狀組裝體結(jié)構(gòu)解析

細菌III型分泌系統(tǒng)(T3SS)存在于多種細菌中，其用于將細菌效應(yīng)蛋白從細菌傳送到宿主細胞中。完整的T3SS包括膜嵌入機體(即針狀體)和宿主膜中的易位孔。T3SS針狀體起著細菌與細胞的通道連接作用，使細菌效應(yīng)蛋白通過該通道注入宿主細胞。T3SS針狀體主要由MxiH蛋白自組裝形成長約100 nm，寬約8 nm的針狀中空絲，單體間排列方式如圖5a，b。了解針狀體的結(jié)構(gòu)與功能幫助我們解決細菌感染，噬菌體入侵等問題。

T3SS針狀體的結(jié)構(gòu)解析采用了13C的稀疏標(biāo)記方法，大大提高了譜圖分辨率，得到了完整的化學(xué)位移歸屬50；并根據(jù)二級結(jié)構(gòu)特點確立了MxiH單體的螺旋發(fā)夾式折疊特征，如圖5c。與Aβ42纖維類似，T3SS針狀體的組裝方式包括側(cè)向堆積和軸向排列，如圖5a。分別利用[1-13C]葡萄糖碳源標(biāo)記，[2-13C]葡萄糖碳源標(biāo)記，以及[1-13C]葡萄糖 :[2-13C]葡萄糖 = 1 : 1的混合標(biāo)記樣品收集結(jié)構(gòu)約束條件，從中提取出明確的單體內(nèi)/單體間結(jié)構(gòu)約束信息，構(gòu)建單體排列的結(jié)構(gòu)模型，如圖5c。由于單體i同時與6個其它單體接觸(i ± 5、i ± 6和i ± 11，如圖5a，d)，界面信息復(fù)雜，存在多種約束可能性，故而結(jié)合圖5c中的結(jié)構(gòu)模型和固體NMR信號的距離上限(～9 ?)進行排除，如圖5d。對于無法手動排除的模糊約束，在結(jié)構(gòu)計算中采用迭代的算法進行自動歸屬。最終，從固體NMR譜中共獲得996個確定的長程約束。

圖5 T3SS針狀體單體界面示意圖Fig. 5 Intermolecular interfaces of the TSSS needle.

利用cryo-EM技術(shù)對T3SS組裝體進行分析，得到分辨率為7.7 ?的結(jié)構(gòu)低溫密度圖。為了提高T3SS針狀體結(jié)構(gòu)的分辨率，提出了固體NMRCryo-EM-Rosetta聯(lián)用技術(shù)。固體NMR和Cryo-EM兩種技術(shù)手段所得的結(jié)構(gòu)信息在分辨率水平上存在差異，整合這兩套數(shù)據(jù)成為實現(xiàn)技術(shù)聯(lián)用的關(guān)鍵。這里利用Rosetta設(shè)計出一種迭代方案來整合這兩套數(shù)據(jù)，該方案可以調(diào)整每種數(shù)據(jù)的權(quán)重大小以滿足數(shù)據(jù)間的自洽性，使得兩種技術(shù)手段的結(jié)構(gòu)信息可以同時應(yīng)用于結(jié)構(gòu)計算，大大提高結(jié)構(gòu)的分辨率。最后計算得到精確度高達0.4 ?的高分辨結(jié)構(gòu)。固體NMR-cryo-EM-Rosetta聯(lián)用方法獲得了分辨率高于任何單一手段的T3SS針狀結(jié)構(gòu)，充分證明的技術(shù)聯(lián)用的優(yōu)勢和可行性，可推廣到其它超分子蛋白組裝體的結(jié)構(gòu)解析中。

6 總結(jié)與展望

在過去的20年中，固體NMR技術(shù)已被證實在蛋白質(zhì)組裝體結(jié)構(gòu)解析中具有很大潛力。常見的蛋白質(zhì)組裝體如蛋白質(zhì)細絲、原纖維或病毒衣殼等，它們通常不易結(jié)晶且難溶解，傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)解析方法如液體NMR，X射線晶體學(xué)方法等很難得到高分辨結(jié)構(gòu)，而固體NMR可在原子水平對這些生物體系進行高分辨結(jié)構(gòu)研究。固體NMR實驗技術(shù)的提升和樣品制備方法的改進都大大促進了固體NMR在蛋白質(zhì)組裝體研究領(lǐng)域的發(fā)展。采用多種13C稀疏標(biāo)記和選擇性標(biāo)記方法有助于提高譜圖分辨率，混合標(biāo)記方法可區(qū)分單體內(nèi)/單體間距離約束條件；多種實驗方法如DARR、PDSD、PAR和TEDOR等可以有效地獲得距離約束，為高分辨結(jié)構(gòu)解析提供條件。氫檢測方法和順磁標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為固體NMR獲取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息提供了新思路，在蛋白組裝體結(jié)構(gòu)的研究中具有很大潛力。固體NMR與多種研究手段(如STEM、X-ray、Cryo-EM、MD、Rosetta等)的強強聯(lián)合，在解析復(fù)雜蛋白質(zhì)體系結(jié)構(gòu)方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。隨著固體NMR技術(shù)以及相關(guān)實驗技術(shù)的進一步發(fā)展，固體NMR在蛋白質(zhì)組裝體結(jié)構(gòu)解析領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，為相關(guān)生物分子的功能和致病機理提供重要的結(jié)構(gòu)信息。