何鑫 ，榮昊 ，任偉宏 ，李延卿 ，李文博 ，馮倩 ，馮慧潔 ，劉朝陽

（1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000）

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因,嚴(yán)重危害人類公共衛(wèi)生健康[1]。盡管當(dāng)今社會(huì)診斷技術(shù)日益進(jìn)步、新型藥物不斷研發(fā)，但肺癌的總體生存率仍然不盡人意[2,3]。2012年全球肺癌死亡人數(shù)高達(dá)1.59億，占所有癌癥死亡人數(shù)的19.4%。非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要類型，占肺癌總發(fā)病率的85%。迄今為止，絕大多數(shù)NSCLC患者在初診時(shí)就已經(jīng)處于中晚期，而現(xiàn)有的治療往往只是暫時(shí)控制癥狀，5年生存率僅為15.9%[4]。然而，如果NSCLC患者能夠做到早發(fā)現(xiàn)、早治療,其生存質(zhì)量以及生存周期都會(huì)得到顯著改善，因此，基于外周血的生物診斷標(biāo)志物正在變得越來越有前景。

外泌體是一種直徑范圍在30～100nm之間的極微小的納米級囊泡結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)，外泌體存在于大多數(shù)體液中，包括腦脊液、母乳、血液、尿液、唾液、羊水和胸腹水積液。在外周血中，外泌體濃度約為3×106/μl。外泌體從多種細(xì)胞中排出，包括紅細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞和癌細(xì)胞，但癌細(xì)胞具有高度活躍的生物學(xué)活性，因此其外泌體分泌量遠(yuǎn)超其它正常細(xì)胞。某些研究已經(jīng)證明外泌體可以與受體細(xì)胞細(xì)胞膜融合，從而將外泌體內(nèi)容物插入受體細(xì)胞。在外泌體的分泌過程中,母體細(xì)胞的類型和生理病理狀態(tài)決定了外泌體的組成和結(jié)構(gòu)[5]。外泌體是多種生物分子的載體，包括蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、DNA、mRNA和microRNA。尤其重要的是，mRNA和microRNA等基因材料作為外泌體內(nèi)容物可被翻譯并調(diào)節(jié)受體或靶細(xì)胞中的基因表達(dá)[6]?，F(xiàn)研究表明，microRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄過程在許多慢性疾病以及癌癥的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[7]。人體內(nèi)的循環(huán)microRNA之所以可以在外周血中穩(wěn)定存在，是因?yàn)楸晃⑴?、外泌體等囊泡包裹，或者與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，免于受到血液中核糖核酸酶（Rnase）的降解以及溫度、酸堿度等不利因素的干擾[8-10]。正是因?yàn)镹SCLC患者外周血中含有大量肺癌細(xì)胞來源的外泌體,本研究通過檢測外泌體中的特異性microRNA來對NSCLC進(jìn)行早期預(yù)測。

EGFR基因是ERBB家族中的一員，對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要作用[11]。如果EGFR基因過表達(dá)或者發(fā)生突變,將導(dǎo)致信號傳導(dǎo)通路的異常，進(jìn)一步導(dǎo)致胞核DNA過度復(fù)制和細(xì)胞過度分裂,最終引起細(xì)胞惡化,形成腫瘤[12]。EGFR基因突變不僅導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生,且影響整個(gè)病程的進(jìn)展，具有促進(jìn)腫瘤生長、分化、浸染的作用。在所有NSCLC患者中，組織EGFR基因突變與外周血EGFR基因突變一致率為70～80%，這與腫瘤細(xì)胞在組織中的分布以及取樣位置有很大關(guān)系,而來源于壞死腫瘤細(xì)胞的ctDNA會(huì)不可避免地進(jìn)入人體外周血,因此可以很好地反映整個(gè)病灶的完整信息[13]。本研究將就外周血EGFR基因突變是否具有預(yù)測NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的能力做出評估。

目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的具有腫瘤監(jiān)測能力的血清學(xué)標(biāo)志物是腫瘤標(biāo)志物，其中，與NSCLC相關(guān)的是癌胚抗原（CEA）、鱗細(xì)胞癌抗原（SCCA）和細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）[14]。CEA由內(nèi)胚層分化而來,是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白，形成于胞漿，并通過細(xì)胞膜釋放入血液。CEA是一種非特異性血清腫瘤標(biāo)志物，在許多實(shí)體瘤中表達(dá)異常，在腫瘤的診斷和療效評估中具有重要參考價(jià)值[15]。SCCA是一種來自于鱗狀上皮細(xì)胞的糖蛋白，主要用于診斷鱗狀上皮細(xì)胞癌[16]。CYFRA21-1是一種細(xì)胞角蛋白,存在于上皮細(xì)胞和來自這些細(xì)胞的惡性腫瘤細(xì)胞,是常用的NSCLC診斷標(biāo)志物[17]。CEA、SCCA、CYFRA21-1是當(dāng)下診斷NSCLC敏感度、特異度相對較好的血清學(xué)標(biāo)志物,本文即通過ROC曲線來對比研究CEA、SCCA、CYFRA21-1及其三項(xiàng)聯(lián)合在NSCLC診斷中的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年6月至11月,于河南省腫瘤醫(yī)院呼吸腫瘤內(nèi)科收集30例確診為NSCLC患者的EDTA-K2抗凝血液標(biāo)本；對照組中的30例EDTA-K2抗凝血液標(biāo)本均來源于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢正常人員。

1.2 儀器與試劑 ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀，微滴式數(shù)字PCR儀，Luminex流式細(xì)胞點(diǎn)陣儀，超凈工作臺，低溫高速離心機(jī)；外泌體提取試劑盒 PureExo Exosome Isolation Kit（P101），外泌體RNA提取試劑盒SeraMir Exosome RNA Amplification（140710-002），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Syntesis Kit（KR211-02）,熒光PCR擴(kuò)增試劑盒miRcute Plus miRNA qP CR Detection Kit（SYBR Green）,人 EGFR 基因T79 0M突變檢測試劑盒，CEA定量測定試劑盒，SCCA定量測定試劑盒，CYFRA21-1定量測定試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 分離血清外泌體 取每例受試者血清樣本400μl，共計(jì)60例，按照外泌體提取試劑盒說明書提取血清外泌體；將分離出的外泌體重懸于PBS溶液中，置于4℃冰箱以備下一步操作。

1.3.2 Western Blot檢測外泌體膜蛋白 取上步得到的外泌體懸液，經(jīng)總蛋白提取、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影等步驟，驗(yàn)證所提取外泌體的膜蛋白。

1.3.3 提取外泌體RNA 按照外泌體RNA提取試劑盒seraMir Exosome RNA Amplification說明書要求提取血清外泌體中RNA；每例樣本應(yīng)當(dāng)獲得30～40μl外泌體RNA;每份外泌體RNA中加入1L外參。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄miRNA-21取出逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，解凍 2×miRNA RT Reaction Buffer并混勻，miRNA RT Enzyme Mix放于冰盒上備用；按照說明書要求逆轉(zhuǎn)錄miRNA-21。

1.3.5 擴(kuò)增miRNA-21待試劑盒室溫融化后置于冰盒上，按照說明書配制反應(yīng)體系，體系配制完成后將所有PCR反應(yīng)管上機(jī)擴(kuò)增。擴(kuò)增所涉及的引物序列見表1。

1.3.6 PCR結(jié)果分析 分析PCR結(jié)果時(shí)，miRNA-21與外參閾值線均取0.01，閾值線與每條擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)即為相應(yīng)的Ct值?；蛩讲捎?-ΔΔCt法計(jì)算，ΔΔCt=（實(shí)驗(yàn)組CtmiRNA-21-實(shí)驗(yàn)組Ct外參）-（對照組 CtmiRNA-21-對照組Ct外參）。

1.3.7 EGFR突變基因檢測 取出DNA提取試劑盒TIANamp FFPE DNA Kit提取血清中EGFR基因，以此作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后將反應(yīng)完成的體系置于微滴讀取儀中讀取結(jié)果。

1.3.8 血清腫瘤標(biāo)志物 CEA、SCCA、CYFRA21-1檢測 將CEA、SCCA、CYFRA21-1檢測試劑盒和Lminex機(jī)器準(zhǔn)備好，室溫下融化血清，混勻后立即離心；分別在96孔反應(yīng)板上依次加入：A液25μl/孔，樣本或校準(zhǔn)品 10μl/孔，B 液 25μl/孔；加樣完成后按照說明書要求在37℃恒溫箱中避光溫浴，然后加入C液25μl；最后把96孔板置于多功能流式細(xì)胞點(diǎn)陣儀讀取結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，外泌體miRNA-21、腫瘤標(biāo)志物數(shù)據(jù)結(jié)果以(x±s)表示，因?qū)嶒?yàn)結(jié)果均不符合正態(tài)分布，兩組間計(jì)量資料比較采用秩和檢驗(yàn),多組間計(jì)量資料比較用KW檢驗(yàn)，行受試者工作特征（ROC）曲線對診斷效能進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot對外泌體膜蛋白的檢測 外泌體表面最具有特異性的膜蛋白是CD63和CD81，根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所提取外泌體含有表面蛋白CD63和CD81，如圖1所示。

圖1 外泌體富含CD63和CD81

2.2 miRNA-21在NSCLC組與正常人組中的表達(dá)水平 PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2、3所示。采用秩和檢驗(yàn)分析可知，NSCLC組血清外泌體miRNA-21較正常人組表達(dá)明顯上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為3.06倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

圖2 NSCLC組外泌體miRNA-21擴(kuò)增曲線（左）和溶解曲線（右）

2.3 外泌體miRNA-21對NSCLC的診斷價(jià)值分析對外泌體miRNA-21表達(dá)水平進(jìn)一步行ROC曲線分析,結(jié)果表明外泌體miRNA-21預(yù)測NSCLC風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值高,曲線下面積為 87.6%（P＜0.05），95%置信區(qū)間為0.784～0.968。當(dāng)miRNA-21表達(dá)水平為54.71時(shí),可得出最佳敏感度(80%)和特異性(86.7%)。 見圖 4。

圖3 正常人組外泌體miRNA-21擴(kuò)增曲線（左）和溶解曲線（右）

表2 NSCLC組與正常人組外泌體miRNA-21對比分析

圖4 外泌體miRNA-21預(yù)測NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線

2.4 肺癌驅(qū)動(dòng)基因EGFR突變檢測結(jié)果 30例NSCLC患者中EGFR基因突變共13例，其中，18號外顯子突變2例，19號外顯子突變6例，20號外顯子突變1例，21號外顯子突變3例，19、20號外顯子聯(lián)合突變1例，總突變率為43.3%；30例正常人中則沒有發(fā)生EGFR基因突變，見表3、表4。

2.5 肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物CEA、SCCA、CYFRA21-1檢測結(jié)果 見表5。

2.6 CEA、SCCA、CYFRA21-1對 NSCLC 的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測分析 CEA曲線下面積為52.1%,SCCA曲線下面積為65.0%,CYFR A21-1曲線下面積為60.9%，三項(xiàng)聯(lián)合曲線下面積為77.3%,95%置信區(qū)間為0.655～0.891。 可知 CEA、SCCA 或 CYFRA21-1單項(xiàng)在預(yù)測NSCLC風(fēng)險(xiǎn)方面并不可靠，但是如果三項(xiàng)聯(lián)合診斷，可明顯提升診斷效能。見圖5。

表3 NSCLC患者EGFR基因突變結(jié)果

表4 正常人EGFR基因突變結(jié)果

表5 NSCLC組與正常人組血清CEA、SCCA、CYFRA21-1

圖 5 血清 CEA、SCCA、CYFRA21-1 及三項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線

3 討論

外泌體被認(rèn)為是普遍存在于人體各種體液，包括母乳、唾液、血清、羊水、惡性腹水和尿液等多種液體中均含有大量可分離的外泌體[18]。外泌體可以作為診斷和治療工具應(yīng)用于臨床。細(xì)胞在正常和病態(tài)條件下均分泌外泌體。外泌體攜帶包含供體細(xì)胞病理信息的各種核酸和蛋白質(zhì),這些核酸和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是具有實(shí)驗(yàn)和臨床診斷價(jià)值的生物標(biāo)志物。在本項(xiàng)研究中，NSCLC患者組血清外泌體miRNA-21表達(dá)水平為119.6498.35,顯著高于正常人組的39.1034.12，證明血清外泌體miRNA-21是NSCLC患病的高危預(yù)測因素，這與NSCLC腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中的結(jié)果一致[9,10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明外泌體作為液體活檢技術(shù)的生物學(xué)意義,以及miRNA-21在NSCLC發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著巨大作用。我們推測，其機(jī)制可能是miRNA-21抑制細(xì)胞的分化并誘導(dǎo)細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。肺癌細(xì)胞源性外泌體通過刺激細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)移和免疫監(jiān)視逃逸來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,并通過轉(zhuǎn)移致癌生物分子如miR NA-21作為其內(nèi)容物來影響受體細(xì)胞。在進(jìn)入靶細(xì)胞后，這些腫瘤來源的內(nèi)容物有助于在受體細(xì)胞中發(fā)展癌癥表型，引起受體細(xì)胞惡變[19]。

近年來，EGFR突變基因檢測在肺部腫瘤相關(guān)疾病中進(jìn)行得如火如荼。EGFR基因位點(diǎn)發(fā)生突變，會(huì)刺激細(xì)胞發(fā)生惡變，開始無休止的增殖，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[20,21]。相比較于其他癌癥，EGFR在NSCLC患者中突變率尤其高，因此，本項(xiàng)研究對30例NSCLC患者和30例正常人外周血EGFR基因突變情況進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在30例NSCLC患者中，EGFR基因總突變率為43.3%,而在正常人中，沒有發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變。因此我們可以得出結(jié)論,用EGFR基因突變作為NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測指標(biāo)具有極好的特異性,但在隨機(jī)選取的30例NSCLC患者中,有56.7%的患者不存在EGFR基因突變,因此用EGFR基因突變作為NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測指標(biāo)存在極大的漏診率,僅可以作為參考指標(biāo)。

腫瘤標(biāo)志物是當(dāng)今用于腫瘤檢測的最為廣泛且相對有效的血清學(xué)標(biāo)志物,其中與NSCLC最具相關(guān)性的是CEA、SCCA、CYFRA21-1。本研究對CEA、SCCA、CYFRA21-1在NSCLC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測中的價(jià)值行ROC曲線分析,結(jié)果顯示,CEA、SCCA、CYF RA21-1的曲線下面積分別為：52.1%、65.0%和60.9%，均不可作為NSCLC的預(yù)測指標(biāo)。三者聯(lián)合起來，作為一個(gè)聯(lián)合診斷指標(biāo)，再次行ROC曲線預(yù)測NSCLC風(fēng)險(xiǎn)，曲線下面積顯著提升至77.3%，從理論上講可以作為NSCLC的診斷指標(biāo)，但是由于在臨床上實(shí)際操作起來需要復(fù)雜的運(yùn)算、缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的診斷界點(diǎn),且診斷效能明顯低于外泌體miRNA-21，所以仍不推薦使用。

外泌體miRNA-21具有較高的NSCLC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測價(jià)值，而EGFR基因突變、肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的NSCLC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測價(jià)值相對較低