張海璐，黃 翔，楊 燃，安鳳平，艾明艷，黃 群,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

蛋白質(zhì)氧化是目前食品化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，發(fā)生蛋白質(zhì)氧化是肉制品加工過(guò)程中影響質(zhì)量的重要因素，不僅會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)、降低肉制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還會(huì)改變?nèi)獾募庸みm應(yīng)性[1-2]。蛋白質(zhì)氧化主要是側(cè)鏈氨基酸發(fā)生修飾，包括巰基氧化、芳香族羥基化和羰基形成[3]。自由基氧化導(dǎo)致肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)和聚集，巰基氧化形成二硫鍵是肌原纖維蛋白交聯(lián)方式的一種[4]。Zhou Feibai等[5]報(bào)道高水平氧化會(huì)誘導(dǎo)肌球蛋白聚集，結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致肌原纖維蛋白凝膠化的改變，但低水平氧化沒(méi)有顯著變化。羥自由基氧化減弱凝膠的強(qiáng)度和持水能力，導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化[6]。隨著氧化程度的加深，羰基含量上升、肌肉微觀結(jié)構(gòu)被破壞，肌原纖維出現(xiàn)小片化，蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊的部分結(jié)構(gòu)遭到破壞，使其凝膠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[7]。已有研究表明，氧化會(huì)對(duì)豬肉、魚(yú)肉凝膠特性產(chǎn)生相關(guān)影響，導(dǎo)致持水性降低，凝膠強(qiáng)度下降等[1,3]。

羊肉肉質(zhì)細(xì)嫩，蛋白質(zhì)含量豐富，膽固醇含量較豬肉和牛肉少，富含豐富的微量元素，是一種受消費(fèi)者喜愛(ài)的優(yōu)質(zhì)畜肉[8]。我國(guó)羊肉生產(chǎn)量、消費(fèi)量較大，相關(guān)研究較多集中于保鮮技術(shù)、貯藏方式及發(fā)酵香腸等[9-12]。羊肉脂肪含量較高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較差，易受加工、環(huán)境條件影響而發(fā)生氧化，目前關(guān)于氧化對(duì)羊肉蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用羥自由基氧化體系，對(duì)羊后腿肉進(jìn)行加速氧化，通過(guò)探究氧化時(shí)間對(duì)蛋白羰基和總巰基含量、凝膠特性和流變性質(zhì)的影響規(guī)律，以期為羊肉的保鮮貯存與加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊后腿肉（8 月齡白山羊） 福州山野農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；復(fù)合磷酸鹽、大豆分離蛋白 廣州嘉業(yè)食品配料有限公司；三氯化鐵、抗壞血酸、過(guò)氧化氫、乙二胺四乙酸、尿素、鹽酸胍、甘氨酸、三氯乙酸（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)絞肉機(jī) 廣州旭重食品機(jī)械有限公司；UV-1780紫外分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems有限公司；TGL-16冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MCR 301流變儀 奧地利安東帕（中國(guó)）有限公司；ADCI全自動(dòng)色差儀 北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

新鮮羊后腿肉于0～4 ℃預(yù)冷1 h，剔除多余脂肪和結(jié)締組織，將羊肉分割成均勻的肉塊（1 cm×1 cm×1 cm），用流水進(jìn)行清洗，紙巾吸干表面水分后放入4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 羊肉氧化處理

參考Li Shugang等[13]的肉氧化處理方法并適當(dāng)修改。將預(yù)處理后的肉樣均分為4 份，紙巾吸干肉塊表面水分，置于Fenton氧化體系（1.0 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸和10 mmol/L H2O2）中，肉樣與氧化液比例為2∶1（g/mL）。密封避光于25 ℃恒溫水浴中分別氧化1、3、5 h，獲得不同氧化時(shí)間的氧化肉樣；添加1.0 mmol/L乙二胺四乙酸溶液螯合氧化體系中Fe2＋，以終止反應(yīng)。所得肉樣置于4 ℃冰箱中2 h后備用。

1.3.3 肌原纖維蛋白提取

參照孫金輝等[14]的方法并稍作修改。稱(chēng)取適量經(jīng)過(guò)氧化打漿后的羊肉糜，添加肉糜質(zhì)量4 倍體積的0.05 mol/L Na2HPO4溶液（pH 7.0）緩沖溶液，高速勻漿1 min后，3 000×g冷凍離心15 min，取殘?jiān)僦貜?fù)提取2 次。將殘?jiān)c4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，高速勻漿30 s后冷凍離心；所得殘?jiān)貜?fù)上述處理2 次，將所獲殘?jiān)c4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，用蒸煮過(guò)的4 層紗布過(guò)濾；調(diào)整pH值為6.2后冷凍離心，所得蛋白膏于4 ℃冷藏，1 周內(nèi)用完。

1.3.4 羰基含量測(cè)定

參照李德海等[15]的方法并稍作修改。將肌原纖維蛋白用0.4 mol/L NaCl磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）溶解，用2,4-二硝基苯肼反應(yīng)測(cè)羰基值。

1.3.5 總巰基含量測(cè)定

參照Wang Yu等[16]的方法并稍作修改。用磷酸鹽緩沖液溶解肌原纖維蛋白，用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)測(cè)定吸光度，用13 600 L/（mol·cm）的摩爾消光系數(shù)計(jì)算總巰基含量。

1.3.6 羊肉糜的制備

處理后羊肉添加2.5%食鹽、0.3%復(fù)合磷酸鹽和2%大豆分離蛋白（以肉質(zhì)量計(jì)），腌制12 h。將腌制好的羊肉打漿3 次（每次30 s）后，加入2%淀粉和20%冰水，繼續(xù)打漿5 min。打漿后肉糜的一部分密封并于4 ℃冷藏，及時(shí)測(cè)定流變特性。使用灌腸器將另一部分肉糜灌入直徑為22 mm的膠原蛋白腸衣中，制備好的腸放入高溫蒸煮袋真空包裝；75 ℃恒溫水浴蒸煮40 min后，流水冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，用于肉糜凝膠特性測(cè)定。

1.3.7 流變性質(zhì)測(cè)定

參照翟小波[17]和Lee[18]等的方法并稍作修改。使用MCR型流變儀測(cè)定不同氧化時(shí)間處理的羊肉糜的熱動(dòng)態(tài)流變性。使用不銹鋼圓形平板探頭50 mm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將肉糜置于2 個(gè)平行平板之間，設(shè)定間隔為1 mm，設(shè)定應(yīng)變?yōu)?%。

動(dòng)態(tài)溫度掃描：用硅油對(duì)暴露的肉糜進(jìn)行密封，防止脫水。于20 ℃平衡10 min，以2 ℃/min的速率從20 ℃升溫至75 ℃并保溫10 min；再以恒定速率2 ℃/min從75 ℃降至20 ℃。固定頻率為0.1 Hz，記錄由于肉糜的剛性引起的任何儲(chǔ)能模量（G′）變化。

動(dòng)態(tài)頻率掃描：0.1～20.0 Hz頻率范圍內(nèi)掃描，記錄在動(dòng)態(tài)掃描范圍內(nèi)的G′和相位角（tanδ）。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)分析和凝膠強(qiáng)度測(cè)定

參照王希希等[19]的方法并稍作修改。將制備好的肉糜腸切成表面平整、高1.5 cm的柱狀，室溫回溫2 h。TPA模式分析質(zhì)構(gòu)，探頭型號(hào)為P36，觸發(fā)力5 g，5.00 mm/s的速度壓縮50%，測(cè)定樣品質(zhì)構(gòu)性質(zhì)。Return To Start模式分析凝膠強(qiáng)度，探頭型號(hào)為P0.5，觸發(fā)力10 g，1.00 mm/s的速度壓縮30%，獲取數(shù)據(jù)速度為200 pps，對(duì)每種類(lèi)型至少6 次重復(fù)測(cè)試。

1.3.9 持水性測(cè)定

持水性用離心法測(cè)量。將厚度為5 mm樣品準(zhǔn)確稱(chēng)質(zhì)量記為m1，后用3 層濾紙包裹，轉(zhuǎn)移到離心管中。4 ℃、5 000×g離心15 min，結(jié)束后對(duì)樣品準(zhǔn)確稱(chēng)質(zhì)量記為m2，持水性計(jì)算如式（1）所示。對(duì)每種類(lèi)型至少6 次重復(fù)測(cè)試。

1.3.10 色澤測(cè)定

用色差儀對(duì)5 mm的樣品測(cè)定L*（亮度）值，a*（紅度）值和b*（黃度）值，用式（2）計(jì)算白度W。對(duì)每種類(lèi)型至少重復(fù)6 次測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DPS 7.55軟件分析，用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白的羰基與總巰基變化

圖 1 羰基和總巰基含量的變化Fig. 1 Changes in carbonyl and total sulfhydryl contents with oxidization time

由圖1可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羰基含量顯著增加（P＜0.05）。羰基為判定蛋白質(zhì)氧化程度的最主要指標(biāo)，羰基含量的增加可能是蛋白質(zhì)的側(cè)鏈或肽鍵受到—OH的攻擊而引發(fā)[20]，α-氨基己二酸半醛和γ-谷氨酸半醛是形成的羰基化合物，是肉系統(tǒng)中蛋白質(zhì)氧化的生物標(biāo)志物，且在氧化過(guò)程中蛋白側(cè)鏈或蛋白空間構(gòu)象也可能發(fā)生改變[21]。此外，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，總巰基含量顯著下降（P＜0.05）。肌原纖維蛋白的總巰基在加工過(guò)程中容易發(fā)生不可逆的氧化狀態(tài)，被氧化成多種氧化產(chǎn)物，使總巰基的含量顯著降低[21]。且多種氧化產(chǎn)物對(duì)肌原纖維蛋白凝膠的形成和維持凝膠有一定影響[22]。

2.2 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜流變學(xué)性質(zhì)的影響

2.2.1 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜G′的影響

G′代表隨著材料的彈性組分變化而發(fā)生的變化趨勢(shì)，主要反映其凝膠能力[23]。如圖2A所示，隨著頻率的上升，羊肉糜的G′都存在不同程度的上升；在相同振蕩頻率下，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，G′降低。其可能原因是氧化時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致凝膠中肌原纖維蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子間相互作用和交聯(lián)改變，從而使得肉糜凝膠結(jié)構(gòu)的聚集度降低，G′相應(yīng)降低[24]。相位角為損耗模量（G′′）與G′的比值，說(shuō)明凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的優(yōu)劣[25]。如圖2B所示，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，tanδ值增加，表明長(zhǎng)時(shí)間氧化會(huì)破壞肉糜凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖 2 羊肉糜在頻率改變過(guò)程中G’（A）和tanδ（B）的變化Fig. 2 Frequency-dependent curves of storage modulus G’ (A) and tanδ (B) for mutton batters with different oxidization times

2.2.2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)氧化羊肉糜G′的影響

肉糜升溫加熱過(guò)程是肉糜受熱變性展開(kāi)、因凝聚作用而形成凝膠體的過(guò)程，屬于不穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)流變進(jìn)程[26]。如圖3A所示，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，各組G′值的變化趨勢(shì)基本趨同；在整個(gè)升溫過(guò)程中，各實(shí)驗(yàn)組有相似的曲線，肉糜的動(dòng)態(tài)流變曲線主要呈現(xiàn)出3 個(gè)階段的變化。在20～47 ℃期間，G′呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，主要原因可能是從低溫開(kāi)始升溫的過(guò)程中肌原纖維蛋白發(fā)生溶解和溶脹[27]；在48～54 ℃期間G′快速下降，氧化時(shí)間越長(zhǎng)G′值越低，有可能是溫度的繼續(xù)升高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分變性和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)解離，肌球蛋白尾部發(fā)生解離而使得流動(dòng)性增加、凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞[18]；在55～75 ℃期間G′隨氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，處于迅速上升的階段，凝膠強(qiáng)度持續(xù)增加，這說(shuō)明繼續(xù)加熱使得具有黏性的肉糜溶膠轉(zhuǎn)變成彈性凝膠[28]，且氧化5 h樣品的最終G′值低于其他組，表明肉糜在長(zhǎng)時(shí)間氧化過(guò)程中遭受破壞。

降溫過(guò)程中體系進(jìn)行重新快速的有序化，體系整體黏彈性增加。如圖3B所示，整個(gè)降溫過(guò)程中凝膠的G′值呈上升趨勢(shì)。氧化5 h蛋白凝膠的G′值低于其他組。隨著溫度的降低，凝膠之間通過(guò)氫鍵等相互作用形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，從而G′升高[29]。

圖 3 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜在溫度改變過(guò)程中G’的影響Fig. 3 Effect of protein oxidation on G’ of mutton batters during heating and cooling

2.3 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表1所示，肉糜的硬度、彈性、凝聚性、膠黏性、咀嚼性、回復(fù)性均隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。硬度和膠黏性在氧化時(shí)間3 h后顯著降低，此前變化不顯著。彈性和凝聚性隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低，回復(fù)性在氧化3 h時(shí)顯著降低。彈性和回復(fù)性的降低說(shuō)明通過(guò)壓縮，肉糜恢復(fù)初始狀態(tài)的能力下降，這與流變性質(zhì)中肉糜的低G′相對(duì)應(yīng)；凝聚性降低說(shuō)明蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)易于破裂。有研究報(bào)道，氧化引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變和交聯(lián)，影響三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致肉糜凝膠特性劣變[30]；隨著氧化程度的加劇，高濃度的氧化會(huì)降低肌原纖維蛋白的硬度和彈性，降低凝膠能力[29]。

表 1 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of protein oxidation on textural properties of mutton batters

2.4 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜凝膠強(qiáng)度的影響

圖 4 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 4 Effect of protein oxidation on gel strength of mutton batters

由圖4可知，氧化時(shí)間與凝膠強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)。與對(duì)照組相比，氧化1、3 h的凝膠強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05），5 h時(shí)趨于平穩(wěn)?？赡苁怯捎谘趸瘯r(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉糜凝膠發(fā)生了部分蛋白與蛋白的交聯(lián)。有研究表明，凝膠強(qiáng)度會(huì)隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而改變，其原因可能與變性造成的蛋白質(zhì)去折疊有關(guān)[3]；還可能是隨著氧化程度的加深，蛋白質(zhì)之間主要支撐凝膠強(qiáng)度的二硫鍵遭到破壞、數(shù)量大幅下降，從而使得凝膠強(qiáng)度降低[31]。

2.5 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜持水性的影響

圖 5 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜持水性的影響Fig. 5 Effect of protein oxidation on water-holding capacity of mutton batters

持水性是肉糜凝膠優(yōu)劣的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，持水性越高，表明肉糜凝膠保持內(nèi)部游離水分的能力越強(qiáng)。由圖5可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉糜凝膠的持水性呈下降趨勢(shì)。氧化時(shí)間在3 h之前，肉糜的持水性顯著降低（P＜0.05）；與氧化3 h樣品相比，5 h樣品的持水性變化不顯著（P＞0.05）?？赡苁且?yàn)榈鞍踪|(zhì)氧化導(dǎo)致疏水基團(tuán)間疏水相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)解聚，降低肌原纖維蛋白凝膠的持水能力，且隨氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)水合能力逐漸下降[32]；同時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)與水分子之間的作用力減弱，使得肉糜的持水性下降[33]。Petracci等[34]的研究結(jié)果也表明肌原纖維蛋白分子之間能形成較理想的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但蛋白質(zhì)氧化會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致凝膠持水性下降。

2.6 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜色澤的影響

表 2 蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜色澤的影響Table 2 Effect of protein oxidation on L*, a* and W values of mutton batters

色澤是影響肉制品食用品質(zhì)、偏好和可接受的重要感官參數(shù)。由表2可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉糜凝膠的L*值和W值呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），a*值呈下降趨勢(shì)。Nyaisaba等[35]報(bào)道了羥自由基氧化處理的鱈魚(yú)魚(yú)糜凝膠的白度隨著氧化程度增加而顯著下降，與本研究結(jié)果吻合。蛋白凝膠白度能反映蛋白質(zhì)的變性程度，羥自由基氧化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生相互反應(yīng)可能致使蛋白質(zhì)凝膠的白度值下降[36]。水分含量也是影響白度值的因素，氧化時(shí)間的延長(zhǎng)使肉糜的持水性下降，從而影響肉糜凝膠的色澤[37]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉糜流變性質(zhì)和凝膠特性的影響，結(jié)果表明，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉糜肌原纖維蛋白的羰基含量顯著增加、總巰基含量顯著降低，表明蛋白質(zhì)氧化程度逐漸增加。隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉糜的G′值降低，tanδ值增加，蛋白質(zhì)氧化能破壞肉糜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。升溫過(guò)程中G′變化存在3 個(gè)階段：20～45 ℃期間為第1階段，G′處于緩慢下降狀態(tài)；46～54 ℃期間為第2階段，G′下降速率加快；55～75 ℃期間為第3階段，G′處于迅速上升狀態(tài)。降溫過(guò)程中G′逐漸回升；氧化時(shí)間越少，G′終點(diǎn)越高。蛋白質(zhì)氧化降低了羊肉糜的彈性、硬度、凝聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性；蛋白質(zhì)氧化時(shí)間延長(zhǎng)，羊肉糜凝膠的持水性降低；隨氧化程度加深，肌原纖維蛋白間二硫鍵減少，凝膠強(qiáng)度顯著降低。隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，a*值呈下降趨勢(shì)，L*值、W值顯著降低。貯藏、加工中蛋白質(zhì)氧化對(duì)羊肉及其制品品質(zhì)的影響機(jī)理有待深入研究，以期為羊肉的貯運(yùn)保鮮和羊肉制品的品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)。