許哲祥，劉玉潔，劉松梅*，鄭春英*

(1.黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)，又名 “山花椒”，是藥食同源功能性保健食品[1]，因其酸、苦、甘、辛、咸五味俱全，其加工產(chǎn)品能保持五味子紅色素的鮮亮[2]，無需添加任何色素成分，因此民間常采用五味子代替花椒作為調(diào)味品使用?，F(xiàn)代研究表明：五味子具有降血糖、鎮(zhèn)靜、止咳、緩解疲勞等作用[3-5]，其主要活性成分是以五味子醇甲為代表的木脂素成分，該類成分具有抗腫瘤、保護中樞神經(jīng)、抗氧化、抗菌等作用[6-9]，是綠色食品、藥品的生產(chǎn)原料及功能型調(diào)味品的重要生產(chǎn)原料[10]。

寒地黑土造就了北方道地藥材五味子的優(yōu)良品質(zhì)、生物活性及保健、調(diào)味功能，由于無節(jié)制的采集使用，五味子現(xiàn)為北方瀕危藥用植物[11]。本文基于內(nèi)生菌參與宿主植物體內(nèi)成分的生物轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生的觀點[12]，采用五味子內(nèi)生菌發(fā)酵五味子，定向高效生產(chǎn)五味子木脂素成分；同時采用柱色譜法同時分離發(fā)酵五味子中4種木脂素成分，以最大限度地使用五味子原料，并為功能性調(diào)味品的生產(chǎn)提供精制原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康野生五味子：采自黑龍江省尚志地區(qū)；五味子內(nèi)生真菌WJ1、WT4、TP2與GP5：由黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業(yè)實驗室分離自健康五味子植株； PDA培養(yǎng)基的配制方法參閱文獻[13]。4種五味子對照品(供含量測定用)：中國藥品生物制品檢定院。

1.2 儀器與設(shè)備

FL2200型高效液相色譜儀 浙江溫嶺福立分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌株的篩選

發(fā)酵樣品的制備：取已活化的五味子內(nèi)生真菌WJ1、TP2、WT4與GP5，參閱文獻[14]，制備1×107CFU/mL的菌懸液；精確稱取五味子粉9 g(過40目篩)，置于三角瓶中，加水(料液比1∶5)，密封，作為底物(121 ℃高壓滅菌30 min)；分別取上述4種菌懸液及無菌水各5 mL加入到底物中(平行樣品制備10份)，置于空氣浴搖床中，發(fā)酵培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：28 ℃，140 r/min，培養(yǎng)15 d)，取出，凍干，作為發(fā)酵樣品，備用。

發(fā)酵前后五味子木脂素成分的動態(tài)變化：采用HPLC法，方法及條件參閱文獻[15]。

對照品溶液的制備：以甲醇為溶劑，分別制備1.0 mg/mL的五味子木脂素(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)對照品儲備液；吸取各對照品儲備液1 mL，制成0.25 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

供試品溶液的制備：分別精密稱取上述各發(fā)酵樣品及生藥五味子1.0 g，以10 mL甲醇超聲提取60 min，取出，放冷，以甲醇補足減失的溶劑，過濾(0.45 μm微孔濾膜)，即為供試品溶液。

HPLC測定：分別精密吸取上述對照品溶液及供試品溶液10 μL(n=3)，進樣，測定，計算含量的動態(tài)變化。

1.3.2 發(fā)酵五味子中木脂素成分的分離

根據(jù)“1.3.1”篩選結(jié)果，取發(fā)酵菌株，按“1.3.1”方法制備五味子發(fā)酵樣品，取五味子發(fā)酵樣品200 g，80%乙醇(料液比1∶8)，85 ℃回流提取2次(每次2 h)，合并提取液，減壓回收溶劑至100 mL時，用乙酸乙酯(100 mL)萃取3次，萃取液濃縮至清膏(相對密度約為1.10)，將其通過硅膠柱層析，依次采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，分離工藝流程見圖1。

圖1 發(fā)酵五味子中4種木脂素成分的分離流程Fig.1 The separation process of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis

1.3.3 發(fā)酵菌株的鑒定

參閱文獻[16]采用形態(tài)學觀察、18S rDNA序列擴增及序列分析法。通用引物NS1、NS6及PCR產(chǎn)物測序均委托生工生物工程(上海)股份有限公司。所得序列數(shù)據(jù)提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，采用Blast分析與GenBank中核酸序列進行比較，通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株篩選結(jié)果

采用HPLC法，分別采用“1.3.1”中的4株五味子內(nèi)生真菌發(fā)酵五味子后，其所含4種木脂素成分(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)含量發(fā)生了動態(tài)變化(此4種木脂素HPLC色譜峰分別采用對照品加入法得到確認)，其中以五味子內(nèi)生真菌WJ1發(fā)酵五味子后，4種五味子木脂素成分提高顯著，結(jié)果見圖2；五味子發(fā)酵后4種木脂素成分含量測定結(jié)果見表1和圖3。

圖2 內(nèi)生真菌WJ1發(fā)酵五味子后的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Schisandra chinensis fermented by endophytic fungus WJ1

注：A為混合對照品；B為五味子生藥；C為WJ1發(fā)酵五味子樣品；1為五味子醇甲；2為五味子酯甲；3為五味子甲素；4為五味子乙素。

由圖2可知，與生藥五味子相比，五味子經(jīng)內(nèi)生真菌WJ1發(fā)酵后，其4種木脂素成分含量發(fā)生顯著增長，并以五味子指標成分五味子醇甲的增長最為顯著；同時，對比圖1不難發(fā)現(xiàn)，五味子在發(fā)酵過程中還有其他成分的產(chǎn)生，說明五味子在發(fā)酵過程中發(fā)生了活性成分的動態(tài)變化。

表1 五味子發(fā)酵樣品中4種木脂素含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of the content of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis samples mg/g

注：同生藥對照組相比，“*”為P<0.05，“**”為P<0.01；同陰性對照組相比，“△”為P<0.05，“△△”為P<0.01。組別1：WJ1發(fā)酵樣品；組別2：TP2發(fā)酵樣品；組別3：GP5發(fā)酵樣品；組別4：WT4發(fā)酵樣品；組別5：五味子生藥；組別6：空白對照組。

圖3 五味子發(fā)酵樣品4種木脂素含量測定結(jié)果Fig.3 Determination results of the content of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis samples

注：組別同表1。

由表1和圖3可知，4株五味子內(nèi)生真菌(WJ1、TP2、WT4和GP5)均能在某種程度上使發(fā)酵五味子樣品中4種主要木脂素活性成分得以提高，并以內(nèi)生真菌WJ1的作用效果最明顯，與生藥五味子相比，WJ1發(fā)酵五味子樣品中4種木脂素(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素及五味子乙素)含量都得到顯著增長，其增長率分別為：38.21%、27.24%、25.03%、39.70%，而且均高于其他3株內(nèi)生菌發(fā)酵樣品中活性成分的漲幅(P<0.01)。因此，選取菌株WJ1作為目的菌株發(fā)酵五味子，以最大化提高五味子中4種木脂素成分含量。

2.2 發(fā)酵五味子中木脂素成分的分離結(jié)果

采用對照品跟蹤法對WJ1發(fā)酵五味子中4種木脂素成分進行分離，隨行薄層層析檢視，合并相同組分，所得4個部位，分別記作Fr1～Fr4，F(xiàn)r1減壓濃縮，重結(jié)晶得到五味子乙素(613.4260 mg，純度96%)；Fr2減壓濃縮，重結(jié)晶得到五味子甲素(348.3487 mg，純度95%)；Fr3減壓濃縮，重結(jié)晶得到五味子酯甲(128.4508 mg，純度97%)；Fr4減壓濃縮，粗品以AB-8大孔樹脂柱(1.5 cm×12 cm)純化，以20%乙醇(V/V)洗脫，所得粗結(jié)晶以乙醚-乙酸乙酯(1∶1)重結(jié)晶后得到五味子醇甲(1614.3684 mg，純度98%)。

上述結(jié)果說明，采用一次柱色譜分離法可以同時分離發(fā)酵五味子中4種主要木脂素成分，該工藝適合木脂素原料的生產(chǎn)。柱色譜分離法為五味子中木脂素成分分離的經(jīng)典方法，盡管眾多文獻報道了五味子中木脂素成分的分離鑒定[17]，但涉及到一次柱層析同時分離五味子中4種主要木脂素成分的方法卻鮮有報道，本文采用硅膠柱層析方法同時分離純化發(fā)酵五味子中4種主要木脂素成分，為制備4種主要木脂素成分奠定了基礎(chǔ)。

2.3 五味子內(nèi)生真菌WJ1鑒定結(jié)果

對五味子內(nèi)生真菌WJ1進行形態(tài)觀察，在PDA培養(yǎng)基上，菌株生長迅速，最初呈白色，隨后密生小顆粒狀黑褐色孢子逐漸增加，菌絲致密，出現(xiàn)頭球狀分生孢子，孢子呈球形；基內(nèi)菌絲無色，無可溶性色素。參閱《真菌鑒定手冊》[18]，初步認定WJ1菌株為絲孢科曲霉屬菌，結(jié)果見圖4。

(a) (b)(10×40)

WJ1菌株P(guān)CR擴增獲得1條 1284 bp的特異性條帶，將所得測序結(jié)果在GenBank中進行Blast同源性比對，然后用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖5)，WJ1與菌株AspergillusnigerHM347449.1的18S rDNA序列的同源性最高，相似性為99%。綜合菌體形態(tài)學鑒定結(jié)果，初步認定WJ1為黑曲霉(Aspergillusniger)。關(guān)于黑曲霉在調(diào)味品中的應(yīng)用已有報道[19,20]，上述研究結(jié)果為深入開發(fā)WJ1奠定了基礎(chǔ)。

圖5 WJ1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of strain WJ1

3 結(jié)論

本研究采用內(nèi)生真菌發(fā)酵五味子，旨在高效利用有限五味子資源生產(chǎn)五味子中4種主要木脂素成分，同時采用柱色譜分離法對發(fā)酵五味子中4種木脂素成分進行了分離純化，并對發(fā)酵菌株進行了鑒定。結(jié)果表明，采用五味子內(nèi)生真菌WJ1發(fā)酵五味子后，五味子中4種主要木脂素成分(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)含量均較發(fā)酵前得到了顯著提高，尤以五味子指標成分五味子醇甲含量提高最為顯著，上述研究說明：內(nèi)生菌發(fā)酵法可定向轉(zhuǎn)化五味子中木脂素成分；同時，采用柱色譜分離法分離發(fā)酵五味子中4種主要木脂素成分工藝適合木脂素原料的工業(yè)化生產(chǎn)。上述研究對于功能性調(diào)味品的生產(chǎn)，可減少配方中五味子原料的使用，起到精制作用；同時，對具有潛在應(yīng)用價值的發(fā)酵菌株WJ1進行了菌株鑒定，后續(xù)可利用該菌株固體發(fā)酵五味子，以改善五味子調(diào)味品中揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量和種類，為研制新型功能性調(diào)味品奠定基礎(chǔ)。