許多 劉梅 楊波 劉 靜 劉子修 司梁宏 陸瑜

摘要 目的：建立院內(nèi)制劑冬蟲夏草膠囊中腺苷含量的測(cè)定方法，為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Hibar-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動(dòng)相為pH值6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇（85∶15）;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm;柱溫30 ℃;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：腺苷在0.032 7～0.163 5 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2=0.999 4）;加樣回收率為99.8%～101.5%;測(cè)定3個(gè)批次的冬蟲夏草膠囊中腺苷的平均含量分別為0.91 mg/粒，0.92 mg/粒，0.93 mg/粒，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.44%、1.15%、2.06%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，靈敏度高，可作為冬蟲夏草膠囊質(zhì)量控制指標(biāo);所測(cè)3批冬蟲夏草膠囊中腺苷的含量相近，質(zhì)量可靠，可用于臨床治療。

關(guān)鍵詞 冬蟲夏草膠囊;腺苷;高效液相色譜法;含量測(cè)定;質(zhì)量評(píng)價(jià);質(zhì)量控制;核苷;腺嘌呤核苷酸

Determination of Adenosine Content in Dongxia Chongcao Capsules by HPLC

XU Duo，LIU Mei，YANG Bo，LIU Jing，LIU Zixiu，SI Lianghong，LU Yu

（Department of Pharmacy，Air Force Hospital of Eastern Theater Command，Nanjing 210002，China）

Abstract Objective：To develop an HPLC method for the determination of adenosine in Dongxia Chongcao Capsules and provide a basis for improving the quality standards of the preparation. Methods：HPLC was used and the analytical column was Hibar-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）. The mobile phase was phosphate buffer pH6.5-methanol （85∶15）. The detection wavelength was 260 nm. The column temperature was 30 ℃. The flow was 1.0 mL/min. The injection volume is 10 μl. Results：Adenosine had a good linear relationship （R2=0.999 4） in the 0.032 7～0.163 5 μg range，and the sample recovery was 99.8%～101.5%. The average contents of adenosine in 3 batch slices of Chinese caterpillar fungus Capsules was 0.91 mg，0.92 mg，0.93 mg. The relative standard deviations （RSD） were 0.44%，1.15%，and 2.06%，respectively. Conclusion：The contents of adenosine in the 3 batches of Dongxia Chongcao Capsules are analogical. This method is simple，accurate and available for the quality control of Dongxia Chongcao Capsules. The 3 batches of Dongxia Chongcao Capsules have similar adenosine content and reliable quality，which can be used for clinical treatment.

Keywords Dongxia Chongcao Capsules; Adenosine; HPLC; Content determination; Quality evaluation; Quality Control; Nucleoside; Adenine Nucleotide

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.004

冬蟲夏草是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。作為我國(guó)特有的名貴藥用真菌，其具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰的功效。本院院內(nèi)制劑蟲草膠囊采用超微破壁技術(shù)，在避免了溶劑提取造成的活性成分的損失的同時(shí)，能夠最大限度釋放冬蟲夏草的活性成分，便于機(jī)體的吸收利用。研究表明，冬蟲夏草的活性成分主要包括：核苷、多糖、蛋白質(zhì)、甾醇等，其中核苷類化合物是近年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。核苷類化合物包括：腺苷、蟲草素、鳥苷、肌苷等。腺苷是腺嘌呤核苷酸的簡(jiǎn)稱，具有改善心腦血液循環(huán)、抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)釋放等活性，已被中華人民共和國(guó)藥典作為冬蟲夏草及其制品的質(zhì)控指標(biāo)[1]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了中華人民共和國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定冬蟲夏草膠囊中腺苷的含量，從而控制其質(zhì)量。

目前針對(duì)腺苷含量的常見(jiàn)測(cè)定方法有薄層色譜法[2]、高效液相色譜法[3-9]和高效液相-質(zhì)譜法[10]等。薄層色譜法較簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確度與專屬性不如另外2種方法;高效液相-質(zhì)譜法準(zhǔn)確度、精密度、專屬性等性能方面優(yōu)越，但其價(jià)格高昂對(duì)人員素質(zhì)要求也較高，不利于方法的普及。高效液相色譜法分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，操作自動(dòng)化，有利于該方法在規(guī)?；繖z測(cè)中的運(yùn)用。

因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)不同批次蟲草膠囊中腺苷含量進(jìn)行測(cè)定，以期作為蟲草膠囊的含量控制方法，完善冬蟲夏草膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-10AT VP高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，日本，型號(hào)：LC-10AT];萬(wàn)分級(jí)電子分析天平（賽多利斯，德國(guó)，型號(hào)：CPA225D）;超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，型號(hào)：KH-300P）。

1.2 試劑 腺苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110879-200202，純度98%）;甲醇（色譜純，德國(guó)默克，批號(hào)：10962907829）;磷酸二氫鉀（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)13121612226）;超純水（密理博，德國(guó)默克公司）。

1.3 分析樣品 冬蟲夏草膠囊（東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院制劑室，批次：ZF0912F001，ZF0912F007，ZF0912F013，蟲草粉末質(zhì)量約0.2 g/粒）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Hibar-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm，流動(dòng)相為pH值6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇（85∶15），檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105 ℃減壓干燥至恒重的腺苷對(duì)照品10.22 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含腺苷8.176 μg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取冬蟲夏草膠囊裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混勻，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz 40 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置5 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取腺苷對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。精密量取冬蟲夏草膠囊適量，按照2.3供試品溶液的制備項(xiàng)下制備樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，建立各樣品的特征圖譜。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液液適量并稀釋至下列濃度：0.82、1.64、3.27、4.91、6.54、8.18 μg/mL，分別精密量取10 μL進(jìn)樣，以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量C（μg）為橫坐標(biāo)，得回歸方程為：A=33 935C+8 538.9，R2=0.999 5，結(jié)果表明，腺苷在0.82～8.18 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。腺苷線性關(guān)系考察結(jié)果如表1和圖1所示。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 取按照2.2和2.3項(xiàng)下制備的腺苷樣品溶液10 μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算腺苷濃度的RSD值。腺苷的RSD為1.12%，結(jié)果表明腺苷的進(jìn)樣精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照2.2和2.3項(xiàng)下操作，制備腺苷供試品溶液，自配制后0，8，16，24 h依次進(jìn)樣10 μL，記錄冬蟲夏草中腺苷含量的變化，評(píng)價(jià)腺苷供試品溶液室溫放置不同時(shí)間的穩(wěn)定情況。結(jié)果腺苷峰面積積分值的RSD為2.06%，說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2和2.3項(xiàng)下操作，取同一批冬蟲夏草膠囊（批次：ZF0912F007）制備6份樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，分別測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算腺苷濃度的RSD值。結(jié)果腺苷的平均含量為0.91 mg/粒，RSD為1.49%，表明重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 按“2.2和2.3”項(xiàng)下操作使用已知濃度的同一批次樣品（腺苷含量為4.66 mg/g）配制9份3組樣品溶液，各組分別準(zhǔn)確加入5 mL腺苷對(duì)照品溶液（0.8、1、1.2 μg/mL），使得腺苷對(duì)照品的添加量滿足樣品量的80%、100%、120%。按“2.1”項(xiàng)下方法操作測(cè)定腺苷的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果腺苷的平均加樣回收率為100.691%，RSD為0.638%。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果 3個(gè)批次冬蟲夏草膠囊，按“2.2和2.3”項(xiàng)下操作，每個(gè)批次制備五份供試品，精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

3 討論

3.1 考察指標(biāo)的選擇 冬蟲夏草膠囊是我院基于中醫(yī)藥理論采用超微破壁技術(shù)制成的中藥制劑，能夠最大限度的釋放冬蟲夏草中活性物質(zhì)，冬蟲夏草成分復(fù)雜，干擾因素多，如核苷、多糖、蛋白質(zhì)、甾醇等物質(zhì)都是其主要活性物質(zhì)，因此建立一個(gè)簡(jiǎn)單可行的含量測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)冬蟲夏草膠囊的質(zhì)量很有必要。冬蟲夏草作為傳統(tǒng)名貴中藥具有廣泛的藥用價(jià)值，現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)了冬蟲夏草中由菌絲發(fā)酵產(chǎn)生的腺苷具有維持心臟、肝臟及腸道的正常功能、保護(hù)血管內(nèi)皮、提高機(jī)體免疫力等多重功效[11-12]，故而本次實(shí)驗(yàn)選擇活性成分腺苷作為評(píng)價(jià)冬蟲夏草膠囊質(zhì)量的指標(biāo)。結(jié)果也顯示其含量較高，容易檢測(cè)，無(wú)干擾，可作為冬蟲夏草膠囊含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

3.2 提取方法的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用乙醇超聲提取40 min，蟲草膠囊中腺苷提取率已維持穩(wěn)定。與加熱回流提取方法比較，引入的干擾雜質(zhì)少、簡(jiǎn)單易行、提取效率高、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好，回收率相似，適用于腺苷的定量分析。

3.3 色譜條件的選擇 以色譜柱Hibar-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），用pH值6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇（85∶15）洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm測(cè)定腺苷的含量。與文獻(xiàn)中方法比較，使用150 mm短柱，分析時(shí)間縮短，8 min即可完成測(cè)定;加入了pH值6.5的磷酸鹽緩沖液，使峰形得到改善，解決了前沿與拖尾的問(wèn)題，峰形更加對(duì)稱，從而使定量更加準(zhǔn)確。