焦偉 崔紅梅 霍葉琳 王靜雅

摘要 目的：探討黃芩苷對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠的影響及作用機(jī)制。方法：參照Clark經(jīng)典模型構(gòu)建復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠，并將成功構(gòu)建好的小鼠隨機(jī)分為模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只;同時(shí)建立正常妊娠小鼠模型10只作為對(duì)照組。于妊娠第2天，實(shí)驗(yàn)組灌胃0.4 mL/mg黃芩苷，模型組和對(duì)照組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，1次/d，連續(xù)干預(yù)7 d。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中激素水平及母胎界面中炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平;免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠子宮組織巨噬細(xì)胞分布情況;蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠子宮組織活化Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB、髓樣分化因子88（MyD88）蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠母胎界面中TNF-α/IL-4為（2.78±0.36），（4.89±0.58）和（3.39±0.34），血清中E2為（25.16±3.69），（17.56±4.52），（22.36±4.16）ng/L。小鼠子宮組織中分化抗原14（CD14）蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（9.36±2.34），（68.12±13.52），（33.46±2.85）%，子宮組織中TLR4蛋白表達(dá)量為（0.23±0.02），（1.25±0.33），（0.45±0.12），核因子-κB蛋白表達(dá)量為（0.59±0.14），（1.52±0.36），（0.78±0.25），MyD88蛋白表達(dá)量為（0.63±0.24），（2.34±0.22），（1.26±0.31），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：黃芩苷可提高復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠雌激素水平，降低母胎界面中炎性狀態(tài)，與抑制子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)控TLR4-核因子-κB信號(hào)通路活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芩苷;反復(fù)自然流產(chǎn);活化Toll樣受體4/核因子-κB信號(hào)通路;活化Toll樣受體4/核因子κB信號(hào)通路

Effects of Baicalin on the Activation of Toll Like Receptor 4/NF-κ B Signaling Pathway in Mice with Recurrent Abortion

JIAO Wei，CUI Hongmei，HUO Yelin，WANG Jingya

（Department of Gynecology and Obstetrics， Baoding First Hospital， Baoding 071000， China）

Abstract Objective：To investigate the effects and mechanism of Baicalin on recurrent abortion mice.Methods：Construction of recurrent abortion mouse was based on Clark′s classic model， and the mice with recurrent abortion successfully constructed were randomly divided into a model group and a test group with 10 mouse in each group.Meanwhile， normal pregnant mice with 10 mouse were as control the group.On the second day of pregnancy， 0.4 mL/mg baicalin was given by gavage in the test group， and 0.9% NaCl was given by gavage in the model group and the control group once a day for 7 days.Enzyme linked immunosorbent assay were used to detect the levels of hormones in serum and content of inflammatory factors in maternal-fetal interface; immunohistochemistry was used to detect the distribution of macrophages in mouse uterus; Western blotting was used to detect the expression of activated toll like receptor 4 （TLR4）， nuclear factorκ B （NF-κB） and myeloid differentiation factor 88 （MyD88） protein expression in mouse uterus.Results：TNF-α/IL-4 were （2.78±0.36）， （4.89±0.58） and （3.39±0.34） in the control group， model group and test group， and E2 were （25.16±3.69）， （17.56±4.52） and （22.36±4.16） ng/L in the serum.The relative expressions of CD14 protein in the mouse uterus were （9.36±2.34）， （68.12±13.52） and （33.46±2.85）， respectively.The expressions of TLR4 protein expressions were （0.23±0.02）， （1.25±0.33） and （0.45±0.12）.NF-κB protein expressions were （0.59±0.14）， （1.52±0.36） and （0.78±0.25）， MyD88 protein expressions were （0.63±0.24）， （2.34±0.22） and （1.26±0.31）， all of which were statistically significant （P<0.05）.Conclusion：Baicalin can improve the estrogen level of mouse with recurrent abortion， reduce the inflammatory state of the maternal fetal interface.It is related to the inhibition of intimal macrophage infiltration and the regulation of TLR4-NFκB signaling pathway activity..

Keywords Baicalin; Recurrent spontaneous abortion; Activation of Toll like receptor 4/nuclear factor kB signaling pathway; Activation of Toll like receptor 4/nuclear factor κB signaling pathway

中圖分類號(hào)：R284;R271.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.007

自然流產(chǎn)的臨床發(fā)生率為15%～25%，反復(fù)自然流產(chǎn)多是指連續(xù)2次或2次以上發(fā)生的自然流產(chǎn)，臨床發(fā)生率為0.4%～0.8%[1-2]。目前西醫(yī)各種免疫治療方案存在較多的風(fēng)險(xiǎn)，如感染、輸血過敏反應(yīng)、激發(fā)和加重自身免疫性疾病等[3]。母胎免疫耐受的形成機(jī)制復(fù)雜，其中子宮局部的免疫調(diào)節(jié)、免疫遺傳等均參與其中;且研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2失衡導(dǎo)致母胎界面局部的細(xì)胞因子紊亂，影響局部?jī)?nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，也影響了母胎免疫耐受[4]。黃芩是我國(guó)具有清熱安胎作用的中藥材，其中黃芩苷是主要的生物學(xué)成分之一，屬于黃酮類物質(zhì)[5]。本研究探討黃芩苷對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 BALB/c小鼠，雌性CBA/J小鼠，雄性DBA/2，SPF級(jí)，8～10周齡;購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-0002;于室溫22～25 ℃，濕度50%～65%，12 h明暗交替環(huán)境下飼養(yǎng)約6 d，完全適應(yīng)新環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.2 藥物 黃芩苷（上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度：98%，批號(hào)：190811）。

1.1.3 試劑與儀器

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y20150608）;二步法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：Z150413）;活化Toll樣受體4（TLR4）（批號(hào)：AB150424）、核因子κB（NF-κB）（批號(hào)：AB150311）、髓樣分化因子88（批號(hào)：MyD88）、抗體（批號(hào)：AB150523），以上購(gòu)于英國(guó)Abcam公司;微量離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司，型號(hào)：MICROCL17）;半自動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：M2245型）;酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK公司，型號(hào)：Powerwave340）;電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：JYH27020）;生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司，型號(hào)：SHP-150）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參照Clark經(jīng)典模型[6]構(gòu)建復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠（雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠按2∶1比例合籠交配），若檢出陰栓或角化細(xì)胞中夾有大量精子則計(jì)為妊娠第0.5天，并將成功構(gòu)建好的小鼠隨機(jī)分為模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只;同時(shí)建立正常妊娠小鼠模型10只（雌性CBA/J與雄性BALB/c小鼠按2∶1比例合籠交配）作為對(duì)照組。

1.2.2 給藥方法 于妊娠第2天，實(shí)驗(yàn)組灌胃0.4 mL/mg黃芩苷，模型組和對(duì)照組注射等量0.9%氯化鈉注射液，1次/d，連續(xù)干預(yù)7 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法[7]檢測(cè)小鼠血清中激素水平：干預(yù)結(jié)束后，取各組小鼠眼眶靜脈血，3 000 r/min離心15 min，ELISA法檢測(cè)上清液中雌二醇（E2）、促卵泡成熟激素（FSH）、血清垂體泌乳素（PRL）水平。

ELISA法[8]檢測(cè)小鼠母胎界面中炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平：干預(yù)結(jié)束后，處死小鼠，取小鼠一側(cè)子宮組織，生理鹽水清洗后制備成組織勻漿，10 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，ELISA法檢測(cè)上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細(xì)胞介素-4（IL-4）水平。

免疫組織化學(xué)[9]檢測(cè)小鼠子宮組織巨噬細(xì)胞分布情況：將小鼠子功組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、3%過氧化氫封閉處理后，加分化抗原14（CD14）一抗（1∶100稀釋），按照試劑盒操作步驟染色。于光學(xué)顯微鏡下判定染色結(jié)果，以Image J軟件進(jìn)行圖像分析，每張照片中陽性染色面積的百分比代表CD14表達(dá)量。

蛋白免疫印跡法（WB）[10]檢測(cè)各組小鼠子宮組織TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白表達(dá)情況：提取各組小鼠子宮胚泡著床部位組織，經(jīng)液氮研磨后，常規(guī)提取組織蛋白，并進(jìn)行定量，然后進(jìn)行蛋白免疫印跡法檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，經(jīng)QWin圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠母胎界面中TNF-α，IL-4炎性反應(yīng)遞質(zhì)比較

與對(duì)照組比較，模型組血清TNF-α水平及TNF-α/IL-4升高，IL-4水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組小鼠母胎界面TNF-α水平及TNF-α/IL-4低于模型組，IL-4水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠血清中E2、FSH、PRL水平比較

模型組小鼠血清中E2，F(xiàn)SH，PRL水平均低于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組小鼠子宮組織巨噬細(xì)胞分布情況

免疫組化染色可見，對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮組織中CD14蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（9.36±2.34）%，（68.12±13.52）%，（33.46±2.85）%，其中模型組小鼠子宮組織中CD14蛋白均高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.4 各組小鼠子宮組織TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白表達(dá)比較

對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮組織中TLR4蛋白表達(dá)量為（0.23±0.02），（1.25±0.33），（0.45±0.12），核因子-κB蛋白表達(dá)為（0.59±0.14），（1.52±0.36），（0.78±0.25），MyD88蛋白表達(dá)量為（0.63±0.24），（2.34±0.22），（1.26±0.31），其中模型組小鼠子宮組織中TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白均高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

3 討論

黃芩及其有效成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷等均顯示出了對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用[11-12]。黃芩苷早期干預(yù)能夠降低妊娠小鼠體內(nèi)IFN-γ水平，提升IL-10水平，改善著床期小鼠子宮微環(huán)境，使子宮局部呈現(xiàn)Th2型反應(yīng);黃芩苷能通過調(diào)節(jié)母胎界面樹突狀細(xì)胞功能，降低復(fù)發(fā)性自發(fā)流產(chǎn)小鼠胚胎吸收率，誘導(dǎo)母胎免疫耐受[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，Th2型反應(yīng)主要存在于正常妊娠時(shí)母胎界面中，表現(xiàn)為TNF-α、IFN-γ、IL-2等Th1型細(xì)胞分泌因子水平降低，以及IL-4、IL-6、IL-10等水平的升高[14]。TNF-α能阻遏Th2型細(xì)胞的分泌及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖;而IL-4是維系妊娠免疫耐受的關(guān)鍵因子，若小鼠體內(nèi)缺乏IL-4，則無Th2型反應(yīng)，其流產(chǎn)率及胚胎吸收率也驟然上升[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)黃芩苷干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組小鼠母胎界面TNF-α水平及TNF-α/IL-4低于模型組，IL-4水平高于模型組。提示黃芩苷可糾正Th1/Th2失衡現(xiàn)象，上調(diào)母胎微環(huán)境中的Th2型細(xì)胞因子水平，使其偏向Th2型，阻礙流產(chǎn)的發(fā)生。同時(shí)本研究還顯示，黃芩苷可有效提高流產(chǎn)小鼠機(jī)體E2、FSH、PRL水平，改善性腺軸內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能。巨噬細(xì)胞的變化是導(dǎo)致小鼠流產(chǎn)的關(guān)鍵，另外其可產(chǎn)生TNF-α，本研究用CD14標(biāo)記子宮巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯低于模型組。研究顯示，TLR4-核因子-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可激活巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)流產(chǎn)的發(fā)生[17-18]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮組織中TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白表達(dá)量均較模型組降低，正常妊娠狀態(tài)下TLR4/核因子-κB信號(hào)可能處于警備狀態(tài)，當(dāng)母胎界面受到刺激后可迅速激活，啟動(dòng)免疫保護(hù)[19]。該結(jié)果也進(jìn)一步提示黃芩苷可能是通過調(diào)控TLR4-核因子-κB信號(hào)通路對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠發(fā)揮治療作用的。

參考文獻(xiàn)

[1]余慶英，杜鑫，巫海旺，等.miR-4684-3p在自然流產(chǎn)患者母胎界面的表達(dá)[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2019，54（2）：113-115.

[2]Muanda FT，Sheehy O，Bérard A.Use of antibiotics during pregnancy and risk of spontaneous abortion[J].CMAJ，2017，189（17）：E625-625E633.

[3]王晶，董光蘋，周娟，等.丹參酚酸B灌胃的免疫性自然流產(chǎn)模型小鼠流產(chǎn)情況、胎盤和脾臟組織淋巴細(xì)胞及炎癥因子表達(dá)觀察[J].山東醫(yī)藥，2019，59（18）：15-18.

[4]Prasad P，Singh N，Das B，et al.Differential expression of circulating Th1/Th2/Th17 cytokines in serum of Chlamydia trachomatis-infected women undergoing incomplete spontaneous abortion[J].Microb Pathog，2017，110：152-158.

[5]岑艷靈，李亞楠，孔晉亮，等.黃芩苷聯(lián)合美羅培南對(duì)小鼠腹腔銅綠假單胞菌早期生物被膜的體內(nèi)影響[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017，27（1）：39-42.

[6]Clark DA，McDermott MR，Szewczuk MR.Impairment of host-versus-graft reaction in pregnant mice.II.Selective suppression of cytotoxic T-cell generation correlates with soluble suppressor activity and with successful allogeneic pregnancy[J].Cell Immunol，1980，52（1）：106-118.

[7]江二喜.左歸丸對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠血清性激素及IL-6、IL-17水平的影響[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，43（8）：909-912.

[8]許春艷，孫晶.泰山磐石散對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子及妊娠預(yù)后的影響[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2016，43（2）：96-98.

[9]周芳，南楠，陳西華，等.PGE2及其受體在小鼠月經(jīng)模型中子宮內(nèi)膜崩解期的含量與表達(dá)研究[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2019，28（5）：536-541.

[10]張金玉，李海霞，郭新宇，等.Meis1在圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)[J].生殖與避孕，2011，31（10）：656-660.

[11]劉瑋，劉澤媛，齊好雯，等.黃芩素作為佐劑對(duì)黑色素瘤小鼠體內(nèi)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志，2018，35（12）：1114-1118.

[12]封桂英，郭亞春，邢恩鴻，等.黃芩莖葉總黃酮對(duì)CIA小鼠細(xì)胞免疫功能的影響[C].濟(jì)南：第九屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)，2014.

[13]張曉思.黃芩苷對(duì)著床期小鼠子宮保護(hù)作用研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[14]賴楠楠.黃芩苷調(diào)節(jié)DC亞群分化與功能治療URSA作用與機(jī)制研究[D].濟(jì)南：濟(jì)南大學(xué)，2016.

[15]劉鳳娟，王志華，仝進(jìn)毅，等.在母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞通過調(diào)節(jié)Th1/Th2及Thl7免疫參與妊娠免疫耐受機(jī)制的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42（10）：78-81.

[16]李怡梅，楊小風(fēng)，王雅莉.淋巴細(xì)胞免疫治療對(duì)小鼠自然流產(chǎn)模型母胎界面Tim-3和GaL-9表達(dá)水平的影響[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2018，24（6）：402-406.

[17]Abkar M，F(xiàn)asihi-Ramandi M，Kooshki H，et al.Intraperitoneal immunization with Urease loaded N-trimethyl Chitosan nanoparticles elicits high protection against Brucella melitensis and Brucella abortus infections[J].Immunol Lett，2018，199：53-60.

[18]柳靜.安子合劑對(duì)APA陽性流產(chǎn)TLR2、TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響及其HPLC指紋圖譜研究[D].南京：中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[19]Mulla MJ，Salmon JE，Chamley LW，et al.A role for uric acid and the Nalp3 inflammasome in antiphospholipid antibody-induced IL-1β production by human first trimester trophoblast[J].PLoS One，2013，8（6）：e65237.

（2020-02-05收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（20150150）作者簡(jiǎn)介：焦偉（1982.05—），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：婦科疾病，E-mail：18461212@qq.com