劉洋 饒秋華 黃敏敏 羅土炎

摘?要：為了明確菌株Salipiger sp.D13對鄰苯二甲酸酯（Phthalates esters，PAEs）的降解特性，對菌株Salipiger sp.?D13基因組序列和對鄰苯二甲酸酯的降解能力進行研究;同時，根據關鍵酶基因和中間代謝物，推測Salipiger sp.?D13代謝鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）的完整途徑。試驗結果表明：菌株Salipiger sp.?D13含有降解鄰苯二甲酸酯的關鍵酶基因，分布在多環(huán)芳烴降解和苯甲酸代謝等代謝途徑中，對6種優(yōu)先級控制PAEs的5 d降解率均在90%以上;菌株Salipiger sp.?D13降解鄰苯二甲酸酯二丁酯（DBP）的完整途徑為鄰苯二甲酸二丁酯通過酯酶水解為鄰苯二甲酸（PA），PA通過加氧酶、脫氫酶、脫羧酶生成原兒茶酸（PCA），PCA通過原兒茶酸3，4加氧酶（protocatechuate 3，4dioxygenase）開環(huán)，形成βcarboxymuconate等物質，從而進入三羧酸循環(huán)。試驗結果可為菌株Salipiger sp.D13用作鄰苯二甲酸酯類污染環(huán)境生物修復的候選菌株提供理論基礎。

關鍵詞：鄰苯二甲酸酯;內分泌干擾毒性;鹽懶惰菌屬;生物降解;代謝通路

中圖分類號：X592?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）02-0001-08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.02.001

Abstract：In order to clarify the degradation characteristics of the strain of Salipiger sp. D13 on phthalates， the genomic sequence of Salipiger sp. D13 and the degradation ability of this strain on phthalates were analyzed. Meanwhile， according to the key enzyme gene and intermediate metabolites， the complete pathway of Salipiger sp. D13 to metabolize DBP was speculated. The results showed that the strain of Salipiger sp. D13 contained the key enzyme genes for the degradation of phthalates， which were distributed in the metabolic pathways such as the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and the metabolism of benzoic acid， and the 5day degradation rates of the six priority controlled PAEs by the strain of Salipiger sp. D13 were all above 90%. The complete pathway of Salipiger sp. D13 to degrade dibutyl phthalate was that：dibutyl phthalate was hydrolyzed to phthalic acid （PA） by esterase.3， and PA produced protocatechuic acid （PCA） by oxygenase， dehydrogenase and decarboxylase， and then PCA was hydrolyzed to the substances such as βcarboxymuconate by ring opening reaction with protocatechuate 3，4dioxygenase， which were then delivered to the tricarboxylic acid cycle. The experimental results could provide a theoretical basis for the application of Salipiger sp. D13 as a candidate strain for the environmental bioremediation of phthalate ester pollutants.

Key words：Phthalate esters;Endocrine disruption toxicity;Salipiger;Biodegradation;Metabolic pathway

鄰苯二甲酸酯（Phthalates esters，PAEs）是一種典型環(huán)境內分泌干擾物，主要用作增塑劑，被廣泛應用于增大產品的可塑性和提高產品的強度中[1]，PAEs具有類雌激素毒性，對人體產生內分泌干擾作用。20世紀末人們開始意識到內分泌干擾物的危害[2]，而后大量的研究表明，PAEs具有致畸、致癌、破壞免疫力和生殖功能等毒性[3-5]。而PAEs作為增塑劑并非共價聚合到塑料產品的基質中，而是由氫鍵或范德華力連接到聚烯烴類塑料分子之間，保留其相對獨立的化學性質。PAEs可由塑料中遷移到外環(huán)境，造成環(huán)境污染[6]，塑料制品等的大量應用導致PAEs在環(huán)境中無處不在。目前，PAEs在全球的生態(tài)環(huán)境中已達到了普遍檢出的程度，在土壤、河流、湖泊、海洋底質、飲用水、垃圾場乃至食品中都能檢測到PAEs的存在[7-10]，PAEs已成為全球最普遍的污染物之一。

微生物降解被認為是自然環(huán)境中PAEs完全礦化的主要過程[11]。鹽懶惰菌屬（Salipiger）最早由MartínezCánovas等[12]提出，目前該屬包含7個種（https：//lpsn.dsmz.de/genus/salipiger），是玫瑰桿菌類群（Roseobacter clade bacteria，RCB）的重要組成單元，在有機物礦化和異源物質代謝循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，如海洋碳源循環(huán)[13]，硫元素循環(huán)[14]等。課題組從深海沉積物中分離出能以鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）和鄰苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DnBP）為唯一碳源生長的菌株，通過16S rRNA基因序列確定其隸屬于鹽懶惰菌屬[15]。本研究擬通過對該菌株基因組功能及其降解PAEs能力的研究，為該菌株在環(huán)境內毒素——鄰苯二甲酸酯微生物降解應用方向提供理論基礎。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

供試菌株分離自深海沉積物，由本實驗室鑒定并保藏于海洋微生物菌種保藏管理中心（Marine Culture Collection of China，MCCC），保藏號為1K02156。

1.2?主要儀器

GCMSTQ8040氣相色譜三重四級桿質譜儀（日本島津公司）;HGC36A氮吹儀（中國天津恒奧有限公司）;KQ500DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）;Anke TDL5A離心機（上海安亭科學儀器廠）;渦旋振蕩器（德國IKA公司）;AL204電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3?主要試劑藥品

鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP），鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP），鄰苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DnBP），鄰苯二甲酸丁芐酯（butyl benzyl phthalate，BBP），鄰苯二甲酸二（2乙基己基）酯[di（2ethylhexyl） phthalate，DEHP]和鄰苯二甲酸二辛酯（dinoctyl phthalate，DnOP） 6種優(yōu)先控制級鄰苯二甲酸酯標準品（stanquick， Stanford Analytical Chemicals Inc.，純度均>98%）;正己烷（德國 Merck 公司，色譜純）;其余試劑無特殊說明均為分析純。

1.4?主要培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基購自于青島海博生物有限公司;PAEs底物的無機鹽培養(yǎng)基（mineral salt medium，MSM）：（NH4）2SO4 1000 mg·L-1，KH2PO4 200 mg·L-1，K2HPO4 800 mg·L-1，MgSO4·7H2O 500 mg·L-1，F(xiàn)eSO4 10 mg·L-1，CaCl2 50 mg·L-1，NiSO4 32 mg·L-1，Na2BO7·H2O 7.2 mg·L-1，（NH4）6Mo7O24·H2O 14.4 mg·L-1，ZnCl2 23 mg·L-1，CoCl2·H2O 21 mg·L-1，CuCl2·2H2O 10 mg·L-1，和MnCl2·4H2O 30 mg·L-1，pH為7，于121℃下高壓蒸汽滅菌 20 min。固體培養(yǎng)基加瓊脂 18.0 g·L-1。

1.5?試驗方法

1.5.1?基因組數(shù)據分析?菌株Salipiger sp.D13基因組測序與拼接參見作者已發(fā)表文章[15]。通過Prodigal version 2.5軟件對編碼基因進行預測，借用蛋白質功能數(shù)據庫COG（Clusters of Orthologous Groups）和代謝通路數(shù)據庫KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）等功能數(shù)據庫與該基因組預測的氨基酸序列逐一進行比對，分別對其蛋白質功能和生物學代謝通路進行預測，其他相關基因單獨提取并注釋。

1.5.2?標準溶液的配制及標準曲線的繪制?①單標儲備液：分別準確稱取 10 mg （精確至 0.01 mg） 各藥劑標準品，用正己烷溶解并定容于 10 mL 容量瓶中，配成1000 mg·L-1的單標儲備液，于-20℃保存。②混合標準工作液：分別移取0.1 mL單標儲備液，用正己烷稀釋并定容于10 mL容量瓶中，配成10 mg·L-1的混合標準工作液，于-20℃保存。③空白基質匹配標準工作溶液：準確移取一定量的混合標準工作液，用空白樣品提取液稀釋為25、50、250、500、1000 ng·mL-1的系列工作液，配制成系列空白基質匹配標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。外標法定量。以峰面積為縱坐標，溶液質量濃度為橫坐標，繪制工作曲線。

1.5.3?PAEs降解?將菌株D13接種到2216E培養(yǎng)基，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)12 h，4℃、4000 r·min-1離心收集細胞，用無機鹽液體培養(yǎng)基重懸至菌液濃度OD 600約為1.0，以此作為種子液，按2%接種量接種到三角瓶中（裝液量50 mL/250 mL），考察該菌株對不同底物（DMP、DEP、DBP、BBP、DnOP、DEHP，分別為50 mg·L-1）5 d降解率，設置不接種微生物的試驗作為對照組，并測定DBP中間代謝物。

1.5.4?PAEs提取?參考王敏等[16]的方法，向50 mL含有不同鄰苯二甲酸酯底物的無機鹽培養(yǎng)液中加入萃取液正己烷20 mL，放入渦旋振蕩器震蕩20 min，超聲儀中萃取30 min，離心分層后取出有機相，再加入20 mL正己烷萃取2次，將3次獲得的有機相混合;將混合液進行N2吹濃縮，用10 mL容量瓶定容;過0.22 μm有機膜，4℃保存待分析。

1.5.5?GCMS測定PAEs及其降解產物?色譜條件：Rxi5 Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;進樣口溫度250℃;柱溫：柱溫箱初始溫度為60℃，以15℃·min-1升至200℃，保持2 min，再以 10 ℃·min-1升至280℃，保持5 min;不分流進樣;進樣量 1 μL;載氣為高純氦氣（99.999%），流速1 mL·min-1。

質譜條件：電子轟擊離子源 （EI源）;電子轟擊中能70 eV;檢測器電壓1.14 Kv;離子源溫度200℃;接口溫度250℃;溶劑延遲2.5 min。

檢測方式：SCAN（全掃描），掃描時段3.00～33.00 min，掃描質量范圍：45～500，掃描間隔：0.5 s。采用全掃描譜庫檢索與相應保留時間提取質量色譜圖進行特征選擇離子定性相結合方法定性。

2?結果與分析

2.1?基因組特征

Salipiger sp.D13基因組序列在GenBank上的登錄號為RAPJ00000000。該菌株基因組測序深度為152，全長為5 217 351 bp，（G+C）%含量為66.7%，無質粒等遺傳物質。

2.1.1?COG功能分類?根據Glimmer（http：//ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml）對基因組的注釋結果，得到3127個已知基因序列。在與COG數(shù)據庫BLASTp比對之后，有90.03%的CDS序列得到功能分類，如圖1所示，其中具有次生代謝產物生物合成、運輸和分解代謝（Q）功能的基因共有111個，具有細胞內物質轉運、分泌和膜泡運輸（U）功能的基因有78個，具有碳水化合物的運輸和代謝（G）功能的基因共有301個，這些基因可能與該菌株降解鄰苯二甲酸酯的功能密切相關。

2.1.2?KEGG代謝通路分類?根據KEGG對菌株D13的分析結果可知，參與異型生物質生物降解和代謝的基因有88個，其中27個基因參與苯甲酸代謝通路（圖2）。PAEs代謝最常見的步驟是從脫酯化作用開始[17]，菌株D13含有5個酯酶（esterases）可能參與鄰苯二甲酸酯酯鍵的水解，生成重要的中間代謝產物鄰苯二甲酸（phthalic acid，PA）;然后通過4，5鄰苯二甲酸雙加氧酶作用于PA，生成順4，5二羥4，5二氫鄰苯二甲酸酯（cis4，5dihydroxy4，5dihydrophthalate），再生成4，5雙羥基鄰苯二甲酸酯（4，5dihydroxyphthalate），最后轉化為原兒茶酸（Protocatechuate，PCA）[18-19];原兒茶酸的環(huán)裂解由內二醇環(huán)裂解雙加氧酶或外二醇環(huán)裂解雙加氧酶等介導，分別產生3羧基粘康酸或4羧基2羥基粘康酸半醛，再將3羧基粘康酸轉化為β酮己二酸并進入β酮己二酸途徑，或將4羧基2羥基粘康酸半醛分解成草酰乙酸和丙酮酸，最終進入三羧酸循環(huán)[19]。菌株Salipiger sp.D13含有dioxygenase， 4，5dihydroxyphthalate dehydrogenase，4，5dihydroxyphthalate decarboxylase，protocatechuate 3，4dioxygenase，intradiol ringcleavage dioxygenase等參與中間代謝物鄰苯二甲酸和原兒茶酸的酶，主要分布于多環(huán)芳烴降解（Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation）和苯甲酸代謝（Benzoate degradation）代謝途徑。

2.2?PAEs標準曲線

以6種鄰苯二甲酸酯濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線如圖3所示，通過擬合得到的直線回歸方程如表1所示，R2均大于0.99，擬合效果較好。

2.3?GCMS 測定PAEs降解率及其降解產物

2.3.1?PAEs降解率?根據PAEs起始濃度、回收率，將終濃度代入標準曲線得到6種鄰苯二甲酸酯的降解率分別如表2所示，6種鄰苯二甲酸酯5 d降解率均大于90%。

2.3.2?PAEs降解產物分析?在DBP降解初期，GCMS檢測到MSM培養(yǎng)基中主要是鄰苯二甲酸二正丁酯（dinbutylphthalate，DBP）。隨著降解時間的增加，12～24 h間，培養(yǎng)基中開始檢測到鄰苯二甲酸單丁酯（monobutyl phthalate，MBP）和鄰苯二甲酸（phthalic acid，PA）（圖4）。在降解過程中，有些代謝產物如原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA），βcarboxymuconate和γcarboxymuconolactone等沒有檢測到，可能是由于這些中間代謝物形成后即被代謝，沒有積累下來。根據DBP中間代謝產物及Salipiger sp.D13所持有的參與DBP代謝的酶，本研究推測出了一條菌株Salipiger sp.D13代謝DBP的降解途徑（圖5）。

3?結論與討論

玫瑰桿菌類群（Roseobacter clade bacteria，RCB）是海洋生態(tài)系統(tǒng)中分布最廣、數(shù)量最多的細菌類群之一，構成了近30%的海洋環(huán)境細菌群落[20]。RCB所有成員都屬于α變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）中的紅桿菌科（Rhodobacteraceae），它們含有豐富的功能基因和具有廣泛的功能特性，如各種有機和無機化合物代謝及功能次級代謝物生產等[21-22]。

本研究從深海沉積物中分離一株能夠降解鄰苯二甲酸酯的細菌，鹽懶惰菌屬（Salipiger sp.D13）?；蚪M數(shù)據分析表明，菌株Salipiger sp.?D13有111個基因注釋到次生代謝產物生物合成、運輸和分解代謝（Q）上，該通路通常與異源物質的分解代謝相關。菌株Salipiger sp.?D13含有與鄰苯二甲酸酯降解相關的酶，如酯酶（esterases），dioxygenase，4，5dihydroxyphthalate dehydrogenase，4，5dihydroxyphthalate decarboxylase，protocatechuate 3，4dioxygenase和intradiol ringcleavage dioxygenase等等，這些酶與其他鄰苯二甲酸酯降解菌株相似[23-24]，主要分布于多環(huán)芳烴降解（Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation）和苯甲酸代謝（Benzoate degradation）代謝途徑。以PAEs濃度和峰面積成功繪制了標準曲線，擬合度均>0.99。PAEs（50 μg·mL-1）的5 d降解率均>90%，表明菌株Salipiger sp.D13對6種優(yōu)先控制級鄰苯二甲酸酯具有較好的降解能力，是鄰苯二甲酸酯的廣譜降解菌。與Gordonia alkanivorans subsp.YCRL2[25]相比，在降解速率和降解率（7 d降解100～800 mg·L-1 DEHP 94.0%以上）上還有差距，可能與降解條件有關，后期試驗需要優(yōu)化降解條件;但比Arthrobacter sp.C21具有較強的降解能力（20 mg·L-1DBP和DEHP 3 d降解率約為52%）[26]。

GCMS檢測到菌株D13降解DBP代謝產物分別為鄰苯二甲酸單丁酯和鄰苯二甲酸，其他代謝產物如原兒茶酸，βcarboxymuconate和γcarboxymuconolactone在發(fā)酵液中沒有積累，因此沒有出現(xiàn)相應的質譜圖，這和Bacillus megaterium subsp.YJB3[27]具有相似的結果。根據檢測到的中間代謝產物，結合菌株Salipiger sp.?D13基因組中持有的相關酶基因，本研究為鹽懶惰菌菌株Salipiger sp.D13推測出了一條完整的DBP代謝路徑，即鄰苯二甲酸二丁酯通過酯酶水解為鄰苯二甲酸（PA），PA通過加氧酶，脫氫酶，脫羧酶生成原兒茶酸（PCA），PCA通過原兒茶酸3，4加氧酶（protocatechuate 3，4dioxygenase）開環(huán)，形成βcarboxymuconate等物質，從而進入三羧酸循環(huán)。Feng[27]等報道了Bacillus megaterium subsp.YJB3擁有一條類似的DBP代謝途徑，但菌株YJB3對其他PAEs的降解能力沒有數(shù)據報道;Tang等[28]也提出了Rhizobium sp.LMB1的DBP代謝途徑，該菌株在代謝過程中出現(xiàn)了Tartaric acid中間代謝物，但在菌株Salipiger sp.D13代謝過程中沒有檢測到Tartaric acid中間代謝物。本研究結果表明，菌株Salipiger sp.D13具有對鄰苯二甲酸二丁酯完整的代謝途徑，同時對其他5種控制級鄰苯二甲酸酯具有較高的降解率，該菌株可作為鄰苯二甲酸酯類污染環(huán)境生物修復的理想候選菌株。

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（責任編輯：林玲娜）