楊明容 陳少美

摘?要：為明確不同蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶分別水解灰樹花蛋白，并測定不同蛋白酶對灰樹花蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性。結(jié)果表明：5種蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度由高到低的順序依次為堿性蛋白酶>胃蛋白酶+胰蛋白酶>胃蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶，以堿性蛋白酶的水解度最高，水解度達(dá)35.48%;堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶的水解產(chǎn)物抗氧化活性均隨著濃度的增加而提高，相同濃度下3種蛋白酶中以堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，當(dāng)其濃度為0.5 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率達(dá)90%以上，與對照Vc相當(dāng)。

關(guān)鍵詞：灰樹花;蛋白;蛋白酶;水解產(chǎn)物;抗氧化活性

中圖分類號：S646?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）02-0021-03

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.02.004

Abstract：In order to determine the hydrolysis degree of different proteases to the protein of Grifola frondosa and the antioxidant activity of the hydrolysates， the pepsin， trypsin， pepsin+trypsin， alkaline protease and papain were used to hydrolyze the protein of Grifola frondosa respectively， and the antioxidant activity of different proteases to the hydrolysates of the protein of Grifola frondosa was determined. The results showed that the hydrolysis degree of the five proteases to the protein of Grifola frondosa was from high to low in the order of alkaline protease>pepsin+trypsin>pepsin>trypsin>papain， and the hydrolysis degree of alkaline protease was the highest， reaching 35.48%. The antioxidant activity of the hydrolysates of alkaline protease， pepsin and pepsin+trypsin increased with the increase of concentration， and the antioxidant activity of the hydrolysates of alkaline protease was the strongest among the three proteases at the same concentration， when the concentration was 0.5 mg·mL-1 and 1.0 mg·mL-1， the clearance rate of DPPH free radical was more than 90%， which was similar to that of the control Vc.

Key words：Grifola frondosa;Protein;Protease;Hydrolysate;Antioxidant activity

灰樹花Grifola frondosa是一種隸屬于多孔菌科、樹花菌屬的珍稀藥、食兩用真菌[1]。該菌多生長于高山闊葉林橡樹、栗樹或常綠針、闊混交林中，在我國的食用歷史悠久，主要分布在河北、吉林、廣西、四川等地[2]。灰樹花富含優(yōu)質(zhì)蛋白、氨基酸、維生素、膳食纖維等，現(xiàn)代科學(xué)已從分子水平上證實(shí)了灰樹花的營養(yǎng)保健功能及其藥用價(jià)值[3-5]。蛋白質(zhì)是灰樹花中高含量的功能性成分，灰樹花蛋白中含有18種氨基酸，其中8種是人體必需的氨基酸，特別是色氨酸含量很高，對于平衡人體的營養(yǎng)成分具有重要作用[6]。近年來，有研究表明灰樹花中特定的蛋白組分還具有抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、降血壓[9]等功效?；覙浠ǘ嗵堑目寡趸饔靡延袌?bào)道[10]，但灰樹花蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性鮮有研究。為此，筆者測定了不同蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，以期為灰樹花蛋白的應(yīng)用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

灰樹花蛋白（實(shí)驗(yàn)室自行制備）;木瓜蛋白酶（800 U·Mg-1，上海源葉生物有限公司產(chǎn)品）;堿性蛋白酶（200 U·mg-1，上海源葉生物有限公司產(chǎn)品）;胰蛋白酶（250 U·mg-1，國藥化學(xué)試劑產(chǎn)品）;胃蛋白酶（1200 U·g-1，國藥化學(xué)試劑產(chǎn)品）;DPPH （Sigma公司產(chǎn)品）。

1.2?儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼公司），細(xì)胞超聲粉碎機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），pH 計(jì)（上海雷磁儀器廠），恒溫磁力水浴鍋（金壇江南儀器廠）。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?灰樹花蛋白的制備?灰樹花蛋白的制備參照陳少美等[11]的方法 。

1.3.2?灰樹花蛋白水解物的制備?灰樹花蛋白水解物的制備參照吳偉菁等[12]的方法。

1.3.3?蛋白酶水解度測定?采用胃蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶分別對灰樹花蛋白進(jìn)行酶解。蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度測定采用甲醛滴定法[13]?。

1.3.4?灰樹花蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性測定?稱取一定量的DPPH，用無水乙醇將其配制成濃度為0.04 mg·mL-1的溶液。分別量取2 mL不同濃度（0.1、0.5、1.0 mg·mL-1）的蛋白酶溶液（堿性蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶、胃蛋白酶），加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，10000 r·min-1離心20 min（10℃），取上清液測定在517 nm處的吸光值為A1;同時，分別在2 mL不同濃度的蛋白酶溶液中加入2 mL無水乙醇，測定吸光值為A2;2 mL DPPH溶液中加入2 mL無水乙醇，測得的吸光值為A0。Vc作為陽性對照。樣品對DPPH自由基的清除率用以下公式計(jì)算：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.3.5?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析?試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行處理與分析，采用單因素方差分析，應(yīng)用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度

從表1可看出，不同蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度由高到低的順序依次為：堿性蛋白酶>胃蛋白酶+胰蛋白酶>胃蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度最高（35.48%），木瓜蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度最低（7.72%），其他蛋白酶的水解度介于兩者之間。

2.2?灰樹花蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性

DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm 處具有特征吸收峰，若測試物能將其清除，則表示測試物具有降低羥自由基、烷自由基或氧化自由基、打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的抗氧化活性。根據(jù)不同蛋白酶對灰樹花蛋白的水解度大小，分別對水解度較高的3種蛋白酶（堿性蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶、胃蛋白酶）進(jìn)行了抗氧化活性測定（表2）。從表2可看出，不同蛋白酶對灰樹花蛋白水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力存在差異，同種蛋白酶水解產(chǎn)物對DPPH 自由基的清除率隨著濃度的增加而提高。相同濃度下，3種蛋白酶中以堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率最高，當(dāng)其濃度為0.5 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1時，清除率達(dá)90%以上，與對照Vc相當(dāng)。

3?討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，5種不同蛋白酶對灰樹花蛋白的水解能力存在一定差異，其水解度由高到低的順序依次為：堿性蛋白酶>胃蛋白酶+胰蛋白酶>胃蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶，以堿性蛋白酶對灰樹花蛋白的水解能力最強(qiáng)，其水解度達(dá)35.48%，木瓜蛋白酶的水解度最低（7.72%）。存在這種現(xiàn)象的原因可能在于堿性蛋白酶的水解位點(diǎn)較多，而木瓜蛋白酶對底物具有特異性選擇。

DPPH自由基的清除能力可能與疏水性氨基酸的含量高低有關(guān)，良好的DPPH自由基清除活性往往伴隨著高含量的疏水性氨基酸或肽[14-15]。本研究中，堿性蛋白酶、胃蛋白酶及胃蛋白酶+胰蛋白酶3種蛋白酶的水解產(chǎn)物均具有一定抗氧化活性，且抗氧化活性隨著蛋白酶濃度的增加而提高。在相同濃度下，以上3種蛋白酶中以堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，當(dāng)其濃度為0.5 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率高達(dá)90%以上，與對照Vc相當(dāng)。由于堿性蛋白酶的切割位點(diǎn)為疏水性氨基酸，因此這可能是其對DPPH自由基清除效果較佳的主要原因。由于酶解反應(yīng)具有復(fù)雜性，本研究涉及的蛋白酶水解產(chǎn)物的具體組成、結(jié)構(gòu)等尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）