谷世江，侯瑞卿，高盛果，孫哲，李向東，翟路峰，金云云，朱巧艷，廖永洪,*，田克恭,b,*

a National Research Center for Veterinary Medicine, Luoyang 471000, China

b College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

1. 引言

人蒼白桿菌（O. anthropi）是一種在環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陰性桿菌。它最先被歸類(lèi)于CDC Vd群[1]，屬于布魯氏菌科[2]。O. anthropi曾被認(rèn)為是一種人類(lèi)條件致病菌，主要感染免疫功能低下的患者[1,3,4]。然而，一些報(bào)道表明O. anthropi也可以引起健康人的感染[5-7]。O. anthropi感染的表現(xiàn)包含眼內(nèi)炎[6]、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、骨軟骨炎、骨髓炎、胰腺膿腫、穿刺傷口、骨盆膿腫和尿路感染[8-14]。據(jù)報(bào)道，除感染人類(lèi)以外，O. anthropi還可以感染其他哺乳動(dòng)物。Franci等[15]首次報(bào)道了健康犬被O. anthropi感染的報(bào)告，該犬在常規(guī)牙齒清潔后被感染，原因是麻醉液被O. anthropi污染。ElAdawy等[16]從火雞的盲腸中分離出O. anthropi。迄今為止，尚未有從其他物種中分離到O. anthropi的報(bào)道。在本研究中，我們首次從豬體內(nèi)分離并鑒定了一株O. anthropi。

2. 材料與方法

2.1. 豬臨床樣本中細(xì)菌的分離

豬腦樣本來(lái)自于中國(guó)江西省的一家商業(yè)化的養(yǎng)豬場(chǎng)。該豬有神經(jīng)癥狀，剖檢觀(guān)察顯示有腦膜炎。對(duì)該豬腦樣本進(jìn)行組織病理學(xué)檢查和細(xì)菌分離。在無(wú)菌條件下用棉拭子從腦樣本中取樣以避免污染。將分離物在含有10%新生牛血清（浙江天杭生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）的胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA; BD DifcoTM，美國(guó)BD公司）上于37 ℃培養(yǎng)24 h。革蘭氏染色根據(jù)Gerhardt等[17]描述的方法進(jìn)行。使用API 20 NE（法國(guó)生物梅里埃公司）對(duì)分離菌進(jìn)行生化鑒定，方法參照廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)。

2.2. DNA模板的制備

使用金唯智公司（中國(guó)）的細(xì)菌基因組DNA試劑盒，對(duì)24 h的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行DNA模板提取，方法參照廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)。

2.3. PCR擴(kuò)增16S rRNA和recA基因及測(cè)序分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

參 照Scholz等[18]描 述 的 方 法 對(duì) 細(xì) 菌16S rRNA基因和recA基因進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物27f（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′） 和反向引 物1492r（5′-AAGTCGTAACAAGGT ARCCG-3′）用于擴(kuò)增16S rRNA基因，擴(kuò)增的目的片段大小約1400 bp。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）程序如下：94 ℃ 5min；隨后94 ℃60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè) 循 環(huán)； 最 后72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。recA基因擴(kuò)增引物為recA-f(5′-ATGTCTCAAAAAAA TTCATTGCGAC-3′)和recA-r(5′-AGCATCTTCTTCCG GTCCGC-3′)；擴(kuò)增recA基因條帶大小為1065 bp。PCR程 序 如 下：94 ℃ 5 min；隨 后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

將PCR產(chǎn)物送至金唯智公司進(jìn)行測(cè)序。序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLASTnx進(jìn)行了BLASTed處理（其中，BLAST為基本局部比對(duì)搜索工具）。使用CLUSTAL X [19]來(lái)比對(duì)序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)基于16S rRNA基因（rrs）和recA基因，使用軟件MEGA版本5 [21,22]采用Kimura的雙參數(shù)模型進(jìn)行分析[20]。進(jìn)化樹(shù)枝干上的數(shù)字表示bootstrap test重復(fù)測(cè)試（1000次重復(fù)）時(shí)相關(guān)物種成簇的樹(shù)的比例[23]。

2.4. 基因組測(cè)序和BLAST分析

基因組序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)基因組BLAST工具進(jìn)行BLAST分析。蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）和布魯氏菌屬（Brucellasp.）的recA、16S rRNA基因的部分序列的GenBank登錄號(hào)，以及部分蒼白桿菌（Ochrobactrum）的全基因組序列的GenBank登錄號(hào)見(jiàn)Appendix A中的Table S1。

2.5. 藥敏試驗(yàn)

參照Bauer等[24]描述的紙片擴(kuò)散法對(duì)分離株進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)。將分離菌株接種于含10%新生牛血清的TSA平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)物用磷酸鹽緩沖液（PBS, 0.01 mol·L-1, pH 7.2）制備成菌懸液，濃度為1× 108CFU·mL-1（其中，CFU代表菌落形成單位）。用無(wú)菌棉簽沾取菌懸液涂布于含有10%新生牛血清的TSA平板上，隨后將藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）放在接種后的瓊脂表面上。將平板底部朝上置于35 ℃孵育24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。參照動(dòng)物細(xì)菌紙片和稀釋法藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布的參數(shù)進(jìn)行結(jié)果判定[25]。

2.6. 小鼠感染試驗(yàn)

將分離株接種含有10%新生牛血清的TSA平板，37 ℃下培養(yǎng)24 h，用PBS（0.01 mol·L-1, pH 7.2）制成活菌含量為5×109～2×1010CFU·mL-1的系列菌懸液。通過(guò)腹腔注射感染BALB/c小鼠，每只小鼠注射菌液0.2 mL，劑量為每只小鼠1×109～4×109CFU。對(duì)死亡小鼠腦組織樣本進(jìn)行組織病理學(xué)觀(guān)察。該動(dòng)物試驗(yàn)參照國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心動(dòng)物保健和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行。

2.7. 組織病理學(xué)觀(guān)察

將腦樣品用10%福爾馬林溶液固定過(guò)夜，然后包埋在石蠟中。將腦組織切片并用蘇木精和伊紅染色以進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估。

3. 結(jié)果

3.1. 組織病理學(xué)檢查和細(xì)菌分離鑒定

豬腦樣本的組織病理學(xué)結(jié)果顯示腦白質(zhì)有壞死性結(jié)節(jié)、灰質(zhì)神經(jīng)元壞死和大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，如圖1所示。將腦樣本劃線(xiàn)TSA平板分離到純的光滑小菌落。革蘭氏染色為陰性桿菌（圖2）。

該分離株為氧化酶和過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，API 20 NE生化鑒定為人蒼白桿菌（O. anthropi）（概率為99.9%）（表 1）。命名為JXLH03B。

3.2. 測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

JXLH03B株16S rRNA基因的序列與蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.，GenBank登錄號(hào)：MH201346.1）、O. anthropi（GenBank登錄號(hào)：LT671861.1）和羽扇豆蒼白桿菌（O. lupini, GenBank登錄號(hào)：KU217325.1）的序列完全相同。recA基因經(jīng)BLAST分析，結(jié)果顯示與O. anthropi（GenBank登錄號(hào)：LT671861.1）序列完全相同。

圖1. 豬腦樣品的組織病理學(xué)觀(guān)察（H＆E，20×）。（a）腦白質(zhì)中的壞死性結(jié)節(jié)（如箭頭所示）；（b）灰質(zhì)神經(jīng)元壞死（如三角形所示）和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（如箭頭所示）。

圖2. 分離物的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)。（a）分離物的菌落形態(tài)；（b）革蘭氏染色后顯微鏡觀(guān)察的細(xì)胞形態(tài)（100×）。

表1 JXLH03B分離株的API 20 NE鑒定結(jié)果

（續(xù)表）

基于16S rRNA基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。如圖3所示，JXLH03B株與O. anthropiLMG7991、O. anthropiOAB、O. anthropiLMG5140、O. anthropiLMG3333、O.anthropiLMG3333T、O. anthropiDSM14396、O. anthropiATCC49188、O. anthropi7b2C和O. lupiniLMG1821處于一個(gè)分支。另外，基于recA基因，JXLH03B株與O.anthropiDSM14396、O. anthropiLMG3333和O. anthropi10CS0094處于一個(gè)分支（圖4）。

3.3. 基因組測(cè)序和BLAST

分離菌株基因組測(cè)序結(jié)果為有兩個(gè)序列，總長(zhǎng)度為4 725 913 bp。G + C含量為56.01%。序列1和序列2的長(zhǎng)度分別為2 641 072 bp和2 088 481 bp。BLAST結(jié)果表明，分離株的基因組序列與已發(fā)表的兩株O. anthropi基因組序列之間的相似度為97.54%～98.08%（表2）。

3.4. 小鼠感染試驗(yàn)

JXLH03B株感染BALB/c小鼠的劑量為每只小鼠1×109～4×109CFU。小鼠死亡率為0/5～5/5（表3）。對(duì)所有死亡小鼠的大腦取樣進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。所有感染后死亡小鼠的腦組織都有炎癥。組織病理學(xué)結(jié)果顯示大腦中有多個(gè)壞死灶。腦實(shí)質(zhì)液化，大量嗜中性粒細(xì)胞壞死聚集形成結(jié)節(jié)（如圖5中箭頭所示）。一些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞崩解（圖5）。

3.5. 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)根據(jù)動(dòng)物細(xì)菌紙片和稀釋法藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)原則，使用紙片擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行[25]。JXLH03B株對(duì)硫酸慶大霉素、丁胺卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素和氟苯尼考敏感，但對(duì)青霉素鈉、頭孢噻呋、卡那霉素硫酸鹽、林可霉素和泰樂(lè)菌素耐藥（表4）。

4. 討論

O. anthropi是一種需氧、非發(fā)酵、運(yùn)動(dòng)、氧化酶陽(yáng)性、脲酶陽(yáng)性的革蘭氏陰性桿菌，曾被稱(chēng)為“無(wú)色桿菌Vd群”[1]。生化反應(yīng)圖譜（API 20 NE）將JXLH03B株鑒定為O. anthropi。Ochrobactrum屬屬于布魯氏菌科，與布魯氏菌有著較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[26]。Ochrobactrum屬包含約16個(gè)種[27]。16S rRNA基因分析用于鑒定和區(qū)分O. anthropi和布魯氏菌屬[2,26,27]。但是，這種方法（尤其是部分測(cè)序）由于其高度的序列相似性而容易誤判這些病原體[27]。同時(shí)，recA基因分析提供了更準(zhǔn)確的識(shí)別和區(qū)分[18,27]。我們對(duì)JXLH03B分離株進(jìn)行16S RNA基因測(cè)序比對(duì)，16S RNA基因比對(duì)結(jié)果不能完全將該菌株鑒定為O.anthropi，結(jié)合recA基因測(cè)序比對(duì)的結(jié)果將分離株鑒定為O. anthropi。

對(duì)小鼠感染試驗(yàn)表明，該菌株具有一定的致病性，可導(dǎo)致小鼠腦部病變。為了測(cè)試JXLH03B株對(duì)豬的致病性，分別對(duì)9頭80日齡的健康豬進(jìn)行攻毒，分別以每頭 豬1.2×109CFU、1.2×1010CFU和1.2×1011CFU的劑量，通過(guò)氣管注射攻毒。但是，攻毒后沒(méi)有豬只表現(xiàn)出臨床癥狀，并且攻毒豬的腦樣本的組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，未能建立O. anthropiJXLH03B株對(duì)健康豬的感染模型。在人類(lèi)中，O. anthropi主要感染免疫功能低下的患者[1,3,4]。我們懷疑感染O. anthropi的豬可能是因其他病原感染導(dǎo)致免疫功能受損引起的，因在患病的豬中檢測(cè)到豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）（數(shù)據(jù)未顯示），而PRRSV會(huì)引起免疫抑制性呼吸系統(tǒng)疾病[28]。O. anthropi廣泛分布于土壤和水中[2]，因此，我們懷疑這只豬由于免疫力低下而通過(guò)以上途徑感染了人蒼白桿菌。

人蒼白桿菌對(duì)除碳青霉烯類(lèi)以外的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥，原因是其能產(chǎn)生AmpCβ-內(nèi)酰胺酶[29]。我們的研究結(jié)果表明，分離株對(duì)青霉素和頭孢噻呋具有抗性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[30]。

圖3. 基于16S rRNA基因使用CLUSTREE鄰接法進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析。比例尺：每個(gè)位點(diǎn)0.002個(gè)不同的殘基。每個(gè)分枝的顯著性用1000次檢驗(yàn)的bootstrap值來(lái)表示。

5. 結(jié)論

在本研究中，我們首次從豬體內(nèi)分離并鑒定了人蒼白桿菌（O. anthropi）。這種細(xì)菌能夠通過(guò)試驗(yàn)感染小鼠并導(dǎo)致典型的腦膜炎，這表明O. anthropi可能具有更廣泛的宿主感染譜。

圖4. 基于recA基因使用CLUSTREE鄰接法進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析。比例尺：每個(gè)位點(diǎn)0.01個(gè)不同的殘基。每個(gè)分枝的顯著性用1000次檢驗(yàn)的bootstrap值來(lái)表示。

表2 JXLH03B株與另外兩株O. anthropi基因組序列的相似性

表3 JXLH03B株感染小鼠結(jié)果

圖5. 小鼠腦樣品的組織病理學(xué)觀(guān)察（H＆E，20×）。腦中出現(xiàn)壞死灶，中性粒細(xì)胞壞死聚集形成結(jié)節(jié)（如箭頭所示）。

表4 JXLH03B分離株紙片擴(kuò)散法藥敏結(jié)果和判定

致謝

本工作得到了國(guó)家“萬(wàn)人計(jì)劃”青年拔尖人才（李向東）和洛陽(yáng)市“河洛英才計(jì)劃”（新型獸用生物制品研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化）（田克恭）的資助。

Compliance with ethics guidelines

Shijiang Gu, Ruiqing Hou, Shengguo Gao, Zhe Sun,Xiangdong Li, Lufeng Zhai, Yunyun Jin, Qiaoyan Zhu,Yonghong Liao, and Kegong Tian declare that they have no conf l ict of interest or fi nacial conf l icts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.08.014.