王麗娟 鄭天翔 楊宋琪 李 欣 羅光宏

1（河西學(xué)院甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心 張掖734000）

2（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院 張掖734000）

3（甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 張掖734000）

4（中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所 蘭州730000）

螺旋藻（Spirulina sp.）是一種原核生物，屬于藍(lán)藻門（Cyanophyta）藍(lán)藻綱（Cyanobacteria）顫藻科（Oscillatoriaceae）螺旋藻屬（Spirulina）。由于含有豐富的蛋白質(zhì)和一些高附加值產(chǎn)物，而具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。目前，螺旋藻的應(yīng)用已從保健食品擴(kuò)大到食品添加劑、醫(yī)藥、飼料和化妝品等領(lǐng)域。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的逐漸擴(kuò)大，篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的螺旋藻品系越來(lái)越受到關(guān)注。但其產(chǎn)量和質(zhì)量不僅受培養(yǎng)條件的影響，還受地區(qū)和環(huán)境因素的制約。現(xiàn)有的螺旋藻品系一個(gè)是非洲Chad湖鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），另一個(gè)是美洲墨西哥Sosa Texcoco 湖極大螺旋藻（Spirulina mxamia）。這兩個(gè)藻種屬于耐高溫品系，對(duì)溫度的耐受性與原產(chǎn)地的溫度接近，這也是我國(guó)螺旋藻養(yǎng)殖區(qū)域主要分布在南方沿海地區(qū)的主要原因。而甘肅張掖位于我國(guó)西北部河西走廊中段，屬于大陸性氣候，氣溫年變化較大，冬冷夏熱，螺旋藻的養(yǎng)殖期普遍較短，容易造成設(shè)備浪費(fèi)。因此，為了提高生產(chǎn)周期和產(chǎn)量，探索適合本地區(qū)溫度生長(zhǎng)繁殖的藻株有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用馴化、自然選擇、物理誘變、化學(xué)誘變和太空誘變育種方式選育出了許多新的螺旋藻藻株［2-7］，但采用碳離子輻照誘變螺旋藻的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

碳離子誘變育種與傳統(tǒng)的輻射法及化學(xué)誘變法相比，具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳相對(duì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，已經(jīng)在微生物以及植物誘變育種中取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益［8-10］。近幾年，在微藻誘變育種中的應(yīng)用也越來(lái)越多，如王芝瑤等［11］利用12C6+離子束對(duì)微擬球藻進(jìn)行誘變育種，獲得了兩株高生長(zhǎng)速率和高油脂產(chǎn)率的突變株。李悅明等［12］對(duì)微擬球藻進(jìn)行了12C6+離子束輻照聯(lián)合三氯生誘變選育，獲得了一種具有較高二十碳五烯酸產(chǎn)量的微擬球藻突變株。王潔［13］研究了12C6+離子束對(duì)四尾柵藻光合系統(tǒng)的影響以及誘變機(jī)理，并篩選得到了光合能力較弱和耐高光的四尾柵藻藻株。

本研究利用12C6+離子束對(duì)螺旋藻進(jìn)行誘變處理，確定致死率；采用平板分離和溫度選育對(duì)大量突變株進(jìn)行初篩，結(jié)合生物量和遺傳穩(wěn)定性等因素篩選溫度耐受突變株，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索螺旋藻優(yōu)良藻種選育的新途徑，并為其進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)基

極大螺旋藻（Spirulina maxima）由甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心提供。培養(yǎng)基為Zarrouk 培養(yǎng)基。配方如下：NaHCO316.80 g/L、NaCl 1.00 g/L、NaNO32.50 g/L、K2SO41.00 g/L、K2HPO40.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、CaCl2·2H2O 0.04 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、乙二胺四乙酸0.08 g/L、A51.00 g/L、B61.00 g/L，調(diào)整pH 為9.0。固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。培養(yǎng)溫度30 ℃，光暗比12∶12 h，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)。（注： A5， H3BO32.86 g/L、MnCl2·4H2O 1.80 g/L、 ZnSO4·7H2O 0.22 g/L、MoO30.01 g/L、CuSO4·5H2O 0.08 g/L；B6，NH4VO322.90 mg/L、 NiSO3·7H2O 47.80 mg/L、 NaWO417.90 mg/L、Ti(SO4)240.00 mg/L、Co(NO3)2·6H2O 4.40 mg/L）。

1.2 方法

1.2.112C16+離子束輻照誘變

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的螺旋藻藻液1.5 mL，藻細(xì)胞初始OD560值（溶液在560 nm波長(zhǎng)處的吸光值）為0.10，置于無(wú)菌平皿中，利用中國(guó)科學(xué)院現(xiàn)代物理研究所蘭州重離子加速器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的12C6+離子束對(duì)螺旋藻進(jìn)行輻照處理，劑量率為80 Gy/min，劑量為0 Gy、200 Gy、400 Gy、600 Gy、800 Gy、1 000 Gy。其中0 Gy為對(duì)照組。

1.2.2 致死率的測(cè)定

將對(duì)照組與不同劑量輻照后的藻液梯度稀釋，吸取0.2 mL 藻液均勻涂布于螺旋藻固體平板培養(yǎng)基上，用封口膜封好，倒置培養(yǎng)，每組做3 個(gè)重復(fù)。在30 ℃下培養(yǎng)21 d，用公式（1）［14］計(jì)算致死率（%）。

1.2.3 溫度耐受突變株的篩選

將輻照后的藻液梯度稀釋，并在無(wú)菌條件下吸取輻照后的藻液0.1 mL 均勻涂布于螺旋藻固體平板培養(yǎng)基上，分別置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2·s)，光暗比為12∶12 h。對(duì)不同溫度培養(yǎng)下生長(zhǎng)迅速的螺旋藻藻株進(jìn)行取樣，置于96 孔板中進(jìn)行單株培養(yǎng)。并用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD560值。當(dāng)藻液OD560≥0.60時(shí)，采用體視鏡單管移液器挑選分離方法，從螺旋藻培養(yǎng)液中吸取少量帶有藻絲體的藻液進(jìn)行稀釋，取稀釋后的藻液置于單凹片上，在低倍鏡下觀察藻絲體，同時(shí)選取單株目標(biāo)藻絲體進(jìn)行培養(yǎng)。重復(fù)上述單株分離選育步驟，直至每一株系形態(tài)穩(wěn)定。最后培養(yǎng)10 d 后測(cè)定生物量，對(duì)生物量提高10%的突變株進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.4 溫度耐受突變株的穩(wěn)定性測(cè)定

將篩選得到的螺旋藻突變株連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，測(cè)定其生物量，以檢測(cè)突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 突變株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的溫度耐受突變株接種至Zarrouk 培養(yǎng)基中，并在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 d，藻細(xì)胞初始接種濃度OD560為0.20±0.02。在最佳耐受溫度下（Sm04#和Sm21#培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃），采用單變量原則分別考察不同pH（7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）、不 同 光 照 強(qiáng) 度（40 μmol/(m2·s)、50 μmol/(m2·s)、60 μmol/(m2·s)、70 μmol/(m2·s)、80 μmol/(m2·s)、90 μmol/(m2·s)、100 μmol/(m2·s)）和 不 同 光 暗 比（8∶16 h、10∶14 h、12∶12 h、14∶10 h、16∶8 h）對(duì)生物量的影響。

1.2.6 測(cè)定方法

生物量的測(cè)定：取一定體積藻液，用混合纖維濾膜（0.45 μm）真空抽濾，于105 ℃烘箱中烘至恒重，見公式（2）。

式中：WD表示單位體積藻體的干重（g/L）；W1為混合纖維濾膜烘至恒重后的質(zhì)量（g）；W2為濾膜和藻樣烘至恒重后的總質(zhì)量（g）；V 為藻液體積（L）。

可溶性糖的測(cè)定：取20 mL藻液離心，藻泥加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.8），混勻后低溫超聲20 min，并于-80 ℃凍融循環(huán)3 次，離心后上清液用于測(cè)定螺旋藻可溶性糖，可溶性糖的測(cè)定采用硫酸蒽酮法。

蛋白質(zhì)的測(cè)定：采用凱氏定氮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 12C16+離子束輻照誘變致死率

輻照誘變螺旋藻致死率結(jié)果見圖1。由圖1 可知，在200 Gy、400 Gy、600 Gy、800 Gy、1 000 Gy時(shí)，致死率分別為38.32%、51.21%、71.84%、78.47%和94.58%。隨著吸收劑量的增加，致死率增大。根據(jù)誘變經(jīng)驗(yàn)，致死率為70%～80%時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較高的陽(yáng)性突變率［15-16］。因此，本研究將劑量在600 Gy 和800 Gy 輻照下的藻株作為重點(diǎn)篩選對(duì)象。

2.2 溫度耐受突變株的篩選

對(duì)600 Gy 和800 Gy 輻照下的螺旋藻藻株通過(guò)不同溫度培養(yǎng)后初步篩選得到156株生長(zhǎng)迅速的突變株，進(jìn)一步從這156株中篩選出2株生物量最高且遺傳穩(wěn)定的耐低溫和耐高溫的突變株。分別是經(jīng)600 Gy 輻照后20 ℃和800 Gy 輻照后35 ℃培養(yǎng)條件下的螺旋藻突變株Sm04#和Sm21#。對(duì)篩選得到的2株溫度耐受突變株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)末期突變株Sm04#和Sm21#的生物量達(dá)到0.54 g/L 和0.91 g/L，較各自對(duì)照組分別提高了11.49%和12.64%，說(shuō)明Sm04#和Sm21#是2 株優(yōu)勢(shì)明顯的耐低溫和耐高溫突變株。

2.3 不同pH對(duì)螺旋藻突變株生長(zhǎng)的影響

在pH 分別為7.0、8.0、8.5、9.0、9.5 和10.0條件下對(duì)突變株Sm04#和Sm21#進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)，光暗比12∶12 h。每隔1 d 用酶標(biāo)儀測(cè)定藻液OD560，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，兩株突變株的最適pH均為9.0，pH為9.5次之，中性環(huán)境生長(zhǎng)最慢。

2.4 不同光照強(qiáng)度對(duì)螺旋藻突變株生長(zhǎng)的影響

在 光 照 強(qiáng) 度 值 分 別 為40 μ mol/(m2·s)、50 μmol/(m2·s)、60 μmol/(m2·s)、70 μmol/(m2·s)、80 μmol/(m2·s)、90 μmol/(m2·s)和100 μmol/(m2·s)條件下對(duì)突變株Sm04#和Sm21#進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃，pH=9.0，光暗比12∶12 h，培養(yǎng)18 d 后測(cè)定藻液OD560，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，Sm04#和Sm21#的最適光強(qiáng)分別為70 μmol/(m2·s)和80 μmol/(m2·s)。

2.5 不同光暗比對(duì)螺旋藻突變株生長(zhǎng)的影響

在光暗比分別為8∶16 h、10∶14 h、12∶12 h、14∶10 h 和16∶8 h 條 件 下 對(duì) 突 變 株Sm04#和Sm21#進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃，光照強(qiáng)度分別為70 μmol/(m2·s)和80 μmol/(m2·s)，pH=9.0，培養(yǎng)18 d 后測(cè)定藻液OD560，結(jié)果見圖5。由圖5可知，Sm04#和Sm21#的最適光暗周期分別為12∶12 h和14∶10 h。

2.6 突變株中蛋白質(zhì)和多糖含量特性

分別將螺旋藻突變株Sm04#和Sm21#在各自適宜的條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并測(cè)定其蛋白質(zhì)和可溶性糖含量，結(jié)果見表1。由表1 可知，在相同培養(yǎng)條件下，突變株Sm04#和Sm21#蛋白質(zhì)的含量分別為70.97%和69.31%，相比各自的對(duì)照組分別增加了5.06%和2.22%，而可溶性糖含量Sm04#和Sm21#相比于對(duì)照分別增加了5.77%和2.11%。

表1 突變株Sm04#和Sm21#中蛋白質(zhì)和多糖含量Table 1 Contents of protein and polysaccharide in the mutant strains Sm04#and Sm21#

3 討論與結(jié)論

重離子束對(duì)生物體的誘變效應(yīng)是將動(dòng)量傳遞、能量和質(zhì)量沉積、電荷中和與交換融合在一起［17］，經(jīng)重離子輻照的細(xì)胞會(huì)生成活性氧簇（ROS），一般包括·O2-、·OH 和H2O2等。ROS 會(huì)通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致DNA 單雙鍵斷裂、蛋白質(zhì)變性、失活等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至導(dǎo)致其壞死。正常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，ROS 濃度很低，不會(huì)引起傷害。但當(dāng)植物處于重離子輻照等逆境條件時(shí)，這種平衡會(huì)遭到破壞［18］。結(jié)果ROS 的濃度超過(guò)了傷害“閾值”，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸、酶結(jié)構(gòu)的氧化破壞，最后導(dǎo)致植物受傷害甚至死亡。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞膜是藻體最先接觸輻照的部位，過(guò)多的活性氧會(huì)引起膜脂過(guò)氧化，而丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化分解的最終產(chǎn)物，是膜脂傷害程度的標(biāo)志。超氧化物歧化酶（SOD）能清除·O2-，可在一定范圍內(nèi)通過(guò)其調(diào)節(jié)使細(xì)胞免受毒害。王潔等［19］研究了重離子輻照對(duì)四尾柵藻MDA 和SOD 的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量輻照時(shí)，MDA和SOD顯著上升后可恢復(fù)至正常水平；高劑量輻照時(shí)，MDA 和SOD 短期內(nèi)下降且不能恢復(fù)正常。說(shuō)明重離子輻照對(duì)藻體有一定毒性，且有一定劑量效應(yīng)。在低劑量時(shí)，藻細(xì)胞能通過(guò)自我調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)增強(qiáng)抗氧化酶活性以增強(qiáng)其抗氧化和抵抗逆境的能力，從而減輕損傷，保證生理代謝的正常進(jìn)行。在較高劑量時(shí)，細(xì)胞維持較高的·O2-，胞內(nèi)的活性物質(zhì)包括酶會(huì)受到損傷，超出機(jī)體的耐受能力。這與重離子輻照對(duì)其他植物的影響結(jié)果一致［20-22］。

可溶性糖是反映植物抗逆性的指標(biāo)，不僅對(duì)細(xì)胞膜和原生質(zhì)體有一定的保護(hù)作用，還起到保護(hù)酶類的作用。植物體經(jīng)過(guò)重離子輻照后在生理上主要表現(xiàn)為可溶性糖含量的增加和生物體內(nèi)活性氧的增加［23］。本實(shí)驗(yàn)中，突變株Sm04#和Sm21#可溶性糖含量都有所積累，并且Sm04#含量高于Sm21#。這可能是因?yàn)榈蛣┝康妮椪帐乖逯甑娜旧w和細(xì)胞膜遭到破壞，促使細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)啟動(dòng)，可溶性糖積累，增強(qiáng)了抵抗逆境的能力，從而維持機(jī)體的正常生理活動(dòng)。而吸收劑量較高時(shí)，藻株的內(nèi)囊體膜受到嚴(yán)重?fù)p害，細(xì)胞所需的能量和有機(jī)物嚴(yán)重供給不足，從而影響了多糖的含量。這與王靜等［24］研究UV-B 對(duì)紫球藻的影響結(jié)果一致，即低劑量促進(jìn)，高劑量抑制。重離子輻照對(duì)其他植物的影響也有相似性，但不同植物的影響趨勢(shì)不盡相同［25-26］，可能與品種間的輻射敏感差異性有關(guān)。蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞內(nèi)的生命物質(zhì)，在細(xì)胞生命活動(dòng)中起非常重要的作用，并且蛋白質(zhì)是親水性膠體，對(duì)膜的保護(hù)性大于可溶性糖。本實(shí)驗(yàn)中，突變株Sm04#蛋白質(zhì)含量高于Sm21#。這可能是因?yàn)樵?00 Gy 時(shí)，藻細(xì)胞自我調(diào)節(jié)以抵抗逆境，激活了相關(guān)蛋白合成基因，合成大量的相關(guān)抗逆蛋白和酶，使蛋白質(zhì)含量增加，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化［22］。而吸收劑量增大時(shí)，推測(cè)可能是由于光合作用場(chǎng)所內(nèi)囊體逐漸溶解和消失，藍(lán)藻細(xì)胞色素的光能捕獲和傳遞能力降低，蛋白電子產(chǎn)率及傳遞速率也隨之降低，蛋白質(zhì)含量下降［27］。600 Gy 輻照處理后的可溶性糖和蛋白質(zhì)均有顯著增加，說(shuō)明600 Gy 輻照處理能增加藻株的抗逆性。這對(duì)螺旋藻抗逆性的提高和新品種的選育具有重要意義。但藻株輻照后測(cè)定的生理生化指標(biāo)偏少，尤其在0～600 Gy 間的變化趨勢(shì)不夠詳盡，因此，重離子輻照對(duì)螺旋藻的抗逆性增強(qiáng)和新品種選育中的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)12C6+離子束對(duì)螺旋藻進(jìn)行輻照，結(jié)合平板分離和溫度選育篩選出2 株溫度耐受株Sm04#和Sm21#，生物量達(dá)到0.54 g/L 和0.91 g/L，較對(duì)照組分別提高了11.49%和12.64%，并優(yōu)化了其培養(yǎng)條件。結(jié)果說(shuō)明，對(duì)采用重離子束輻照聯(lián)合溫度選育的方法，可以獲得溫度耐受高產(chǎn)螺旋藻突變

株，但是否產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢(shì)明顯尚有待于室外大規(guī)模培養(yǎng)驗(yàn)證。