李寶華，戈海澤，劉樹業(yè)

天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300170

肝癌作為最常見的肝臟原發(fā)性腫瘤，是世界五大惡性腫瘤之一，位居腫瘤致死原因的第3位。肝癌常伴隨肝炎、肝硬化[1]，所以人們認(rèn)為病毒性肝炎、飲酒過度、遺傳及非酒精性脂肪性病變是肝癌發(fā)生的重要原因[2-3]。原癌基因激活、抑癌基因失活及信號(hào)通路過度活化是肝癌發(fā)生的主要分子機(jī)制[4]。近年來，隨著miRNA研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA與肝癌的發(fā)生和發(fā)展有著十分重要的聯(lián)系[5-6]，miRNA成為研究肝癌的熱點(diǎn)之一[7]。miRNA是一段內(nèi)源性單鏈小片段非編碼RNA，有18～25個(gè)核苷酸，一般是通過靶向mRNA 3′UTR來調(diào)控細(xì)胞基因的表達(dá)[8]，從而廣泛參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、代謝等[9-10]。已有研究表明，許多miRNA(如miR-122、miR-199 和miR-21)[11-13]通過調(diào)控基因表達(dá)從而影響細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移，參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程[14-15]。本研究以肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞為模型，研究miR-499在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 人肝癌細(xì)胞株 Huh7 來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。于本院肝外科采集配對(duì)的肝癌組織標(biāo)本和正常癌旁組織標(biāo)本各20例，以及另外的35例肝癌組織標(biāo)本。 本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過，并與患者簽訂知情同意書。

1.2主要試劑 10 %胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自Gibico公司，1%青霉素-鏈霉素雙抗購自Sigma公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)定量試劑盒、CCK8試劑盒均購自Thermo公司。RIPA全蛋白裂解液、脂質(zhì)體2000、碘化丙啶購自Sigma公司。RAB5C一抗購自Abcam公司，結(jié)晶紫試劑購自Solarbio公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Huh7細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件37 ℃、5%CO2。當(dāng)細(xì)胞融合度在90%左右時(shí)0.25%胰酶消化傳代，每3天換液或傳代1次。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染方法，細(xì)胞傳代后在細(xì)胞融合度為60%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-499 mimics。

1.3.2RT-qPCR 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24～48 h后收集細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍或?qū)⒔M織勻漿后加入Trizol提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，稀釋cDNA后按照RT-qPCR定量試劑盒進(jìn)行40個(gè)PCR。引物如下，miR-499-RT primer:5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTG CAC TGG ATA CGA CAA ACA T-3′;miR-499-qPCR-Fwd:5′-TGC GGT TAA GAC TTG CAG TG-3′；U6-RT:5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；Oligo-dT:5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3′；U6-Fwd:5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′；miRNA-universal reverse:5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；RAB5C-qPCR-Fwd：5′-TCC TCC GCC TGA ATG ACC-3′；RAB5C-qPCR-Rev：5′-GGG AGG AAG TGG GAA GAG-3′。

1.3.3CCK8試驗(yàn) 按要求將Huh7細(xì)胞鋪96孔板，5×103個(gè)細(xì)胞/孔，每組3個(gè)復(fù)孔。Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-499 mimics 24 h后，分別于0、24、48、72 h向每孔加10 μL CCK8溶液，測量450 nm處吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖活力。

1.3.4集落生成試驗(yàn) Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-499 mimics 24 h后，胰酶消化鋪入24孔板，約500個(gè)細(xì)胞/孔。每72小時(shí)換一次培養(yǎng)基，2周后1×PBS洗2遍，普通結(jié)晶紫染色并記錄集落形成個(gè)數(shù)，每個(gè)集落細(xì)胞數(shù)大于50，重復(fù)3次。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-499 mimics 48 h后，胰酶消化，1×PBS洗2遍，加入70%乙醇溶液固定過夜。離心收集細(xì)胞，1 mL 1×PBS洗2遍，加入500 μL 1×PBS含50 μg/mL溴化乙錠，100 μg/mL RNase A 4 ℃避光，30 min。1×PBS洗1遍終止反應(yīng)，流式上機(jī)檢測。

1.3.6Western blot試驗(yàn) Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-499 mimics 48 h后，1×PBS洗2遍，按說明書加入適量RIPA全蛋白細(xì)胞裂解液4 ℃裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液。BCA蛋白定量后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣15 μg，轉(zhuǎn)膜后5 %脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵一抗搖床過夜。第2天Tri吐溫鹽酸緩沖液洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，暗室曝光。

2 結(jié) 果

2.1肝癌組織和正常癌旁組織miR-499表達(dá)水平比較 通過TCGA及GEO公共數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-499表達(dá)水平在肝癌組織標(biāo)本中是降低的，與正常癌旁組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A、圖1B)；采用RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，肝癌組織miR-499表達(dá)水平明顯低于正常癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1C)。

2.2miR-499與肝癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 見表1。通過臨床標(biāo)本數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-499的肝癌患者中普遍存在腫瘤體積較小、TNM分期較低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力較弱且分化良好等臨床表型。

注：A為TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-499的表達(dá)水平;B為GEO數(shù)據(jù)庫分析miR-499的表達(dá)水平;C為RT-qPCR檢測miR-499的表達(dá)水平。

圖1 肝癌組織和正常癌旁組織miR-499表達(dá)水平比較

表1 miR-499與肝癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系(n=35)

2.3miR-499抑制肝癌Huh7細(xì)胞的增殖能力 為進(jìn)一步闡明miR-499在肝癌進(jìn)程中如何發(fā)揮其生物學(xué)作用，本研究通過miR-499 mimics轉(zhuǎn)染肝癌Huh7細(xì)胞，檢測miR-499對(duì)肝癌細(xì)胞活性和集落形成能力的影響。CCK8試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-499 mimics 轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活性明顯受到抑制，與miR-NC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A)；細(xì)胞集落形成試驗(yàn)表明，過表達(dá)miR-499明顯抑制Huh7細(xì)胞的集落形成能力，與miR-NC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B、C)。

2.4miR-499抑制Huh7細(xì)胞的周期進(jìn)程，促進(jìn)Huh7細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-499能明顯抑制Huh7細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，與miR-NC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A、B)；流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-499能明顯促進(jìn)Huh7細(xì)胞的凋亡能力，與miR-NC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3C、D)。

2.5miR-499直接靶定RAB5C 通過TargetScan7.1、MicroRNA.org、MiRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-499的下游靶基因?yàn)镽AB5C(圖4A)；RT-qPCR顯示，miR-499 mimics轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后，RAB5C mRNA表達(dá)水平明顯下降，與miR-NC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4B)；Western blot試驗(yàn)顯示，miR-499 mimics能夠明顯降低RAB5C蛋白表達(dá)水平，與miR-NC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C、D)。miR-499可直接靶定RAB5C并抑制RAB5C的表達(dá)水平。

注:A為CCK8試驗(yàn)檢測miR-499對(duì)細(xì)胞活性的影響；B為集落形成試驗(yàn)檢測miR-499對(duì)細(xì)胞相對(duì)集落形成能力的影響；C為集落形成試驗(yàn)。

圖2 miR-499抑制肝癌Huh7細(xì)胞的增殖能力

注:A為流式細(xì)胞周期試驗(yàn)檢測miR-499對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響；B為流式細(xì)胞周期試驗(yàn)；C為流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)檢測miR-499對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；D為流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)。

圖3 miR-499對(duì)Huh7細(xì)胞周期及凋亡的影響

注:A為軟件預(yù)測miR-499的靶基因；B為RT-qPCR檢測miR-499對(duì)RAB5C mRNA的影響；C為Western blot試驗(yàn)檢測miR-499對(duì)RAB5C 蛋白水平的影響；D為Western blot試驗(yàn)。

圖4 miR-499直接靶定RAB5C

3 討 論

肝癌是發(fā)病率和致死率都很高的一種惡性腫瘤，當(dāng)前治療手段有限，早期診斷困難是一直困擾人們的主要問題[16-17]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA作為廣泛存在的分子調(diào)控者參與了細(xì)胞的生長、增殖、遷移、分化、代謝等很多生物學(xué)表型[5]。隨著研究者對(duì)miRNA更加深入的研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與miRNA的表達(dá)水平存在很密切的聯(lián)系[18]。但是，不同的miRNA調(diào)控不同的基因表達(dá)變化，其調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性仍需要不斷探究[19]。

有研究報(bào)道，miRNA在肝癌中差異表達(dá)是廣泛存在的現(xiàn)象，在肝癌中表達(dá)下調(diào)的miRNA有許多已被證實(shí)具有抑制肝癌的作用，如miR-125b、miR-199、miR-101等[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在TCGA和GEO公共數(shù)據(jù)庫及在肝癌患者的臨床組織標(biāo)本中miR-499表達(dá)水平明顯減少，提示miR-499可能在肝癌發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。通過臨床病例分析及相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-499能抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞凋亡，并且能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。同時(shí)，本研究初步探究了miR-499抑制肝癌惡性表型可能的分子機(jī)制，并通過試驗(yàn)證明miR-499的下游靶基因之一是RAB5C，這也為進(jìn)一步探究miR-499抑制肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供了新的思路。

本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-499的表達(dá)水平在肝癌患者中呈低表達(dá)，從而猜想miRNA可能與肝癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，miR-499能抑制Huh7細(xì)胞的增殖、集落形成及周期進(jìn)程，并且可以促進(jìn)Huh7細(xì)胞的凋亡。本研究探究miR-499在肝癌發(fā)生和發(fā)展中可能的下游靶基因RAB5C，并通過RT-qPCR和Western blot試驗(yàn)證明RAB5C確為miR-499的下游靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-499通過下調(diào)RAS癌基因家族成員RAB5C，從而抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展。目前尚不清楚miR-499是如何通過RAB5C來調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，從而抑制Huh7細(xì)胞的增殖、集落形成及周期進(jìn)程，并且促進(jìn)Huh7細(xì)胞凋亡，但本研究也為miR-499在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制開啟了新思路。

本研究結(jié)果表明，miR-499可能通過下調(diào)RAB5C抑制肝癌細(xì)胞的周期進(jìn)展及促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡來抑制肝癌細(xì)胞的增殖，從而抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究初步探究了miR-499、RAB5C與肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、增殖之間的關(guān)系，但具體分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探索。