劉庭玉，高振軍，沈曼茹，黃繼英，唐鄂，張國新

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院，上海201799

幽門螺桿菌為革蘭陰性微需氧菌，屬于胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境中的代表性菌，已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子，根除幽門螺桿菌可有效降低胃癌發(fā)生率[1]。幽門螺桿菌感染可競爭性抑制胃內(nèi)其他菌群定植，導(dǎo)致胃內(nèi)菌群豐度改變，從而影響菌群代謝物的產(chǎn)生及其含量變化[2]。丁酸屬于短鏈脂肪酸的一種，可由胃內(nèi)菌群代謝生成，在調(diào)節(jié)宿主代謝、免疫系統(tǒng)和細胞增殖方面均具有關(guān)鍵作用。丁酸是丁酸鹽在體內(nèi)的主要成分，目前關(guān)于其是否參與胃癌的發(fā)生鮮見報道。2015年8月～2017年3月，本研究觀察了幽門螺桿菌對小鼠胃內(nèi)常見菌群及短鏈脂肪酸的影響，并探討丁酸鹽對胃癌細胞增殖、遷移的影響，以期為探討幽門螺桿菌促進胃癌發(fā)生的相關(guān)機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級C57BL/6雌性小鼠24只，體質(zhì)量18～22 g，周齡6～8周，購于南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。細胞：人胃癌細胞系A(chǔ)GS購于上海ATCC研究所。菌株：VacA(+)、CagA(+)的幽門螺桿菌悉尼菌株(H.pylori SS1)購于上海ATCC研究所。主要試劑：FBS、RPMI 1640購于美國Gibco公司，青/鏈霉素混合液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，布氏肉湯、哥倫比亞瓊脂、丁酸鹽購于美國Sigma公司，脫纖維綿羊血購于南京羊血供應(yīng)站，混合型氣體(10% CO2、5% O2、85% N2)購于南京天澤氣體有限責(zé)任公司。主要儀器：高效液相色譜儀購于美國Waters Beeze公司。

1.2 幽門螺桿菌感染小鼠胃內(nèi)常見菌群及短鏈脂肪酸變化觀察

1.2.1 動物分組處理 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為幽門螺桿菌組及對照組，每組12只。幽門螺桿菌組灌胃前禁食24 h、禁水6 h，每只小鼠先給予2% NaHCO30.1 mL灌胃，15 min后給予濃度為3×108cfu/mL的H.pylori SS1菌液0.3 mL灌胃；隔日1次，共3次。對照組禁食24 h、禁水6 h，給予布氏肉湯0.4 mL灌胃；隔日1次，共3次。兩組灌胃后均禁食、禁水12 h，隨后恢復(fù)正常飲食飲水。兩組灌胃后6、12個月分別取6只小鼠，均予頸椎脫臼法處死，解剖取出胃組織，立即置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 胃內(nèi)常見菌群豐度檢測 采用real-time PCR法。取兩組灌胃后12個月的胃組織，將組織用剪刀剪碎，置于勻漿器中攪拌至泥漿樣。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，由上海諾百生物科技有限公司完成細菌標準品的制備。按照1×102～1×109每10倍梯度，使用Biophotmeter檢測儀自動制備標準曲線；根據(jù)制成的標準曲線，計算每個待測樣本的數(shù)目。PCR反應(yīng)體系10 μL：去離子水3.6 μL， SYBR Green(包括4×dNTP，MgCl2和Taq聚合酶，10×緩沖液)5 μL，上、下游引物(25 mmol/L)各0.2 μL，DNA提取模版1.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)，4 ℃保存。使用溫度梯度PCR擴增儀檢測乳酸桿菌、柔嫩梭菌、擬球梭菌、普氏桿菌、擬脆弱桿菌、腸桿菌及幽門螺桿菌等菌群豐度。

1.2.3 胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平檢測 采用高效液相色譜法。取兩組灌胃后6、12個月的胃組織各100 mg，加入1 mol/L鹽酸飽和氯化鈉溶液100 μL進行酸化。配置SCFAs標準品10 mg/mL，并依次稀釋為1、5、10、50、500 μg/mL的標準圈樣本。使用高效液相色譜儀檢測乙酸、丙酸、丁酸水平，參數(shù)設(shè)置：流速10 μL/20 min，柱溫為室溫，檢測波長210 nm。

1.3 丁酸鹽對胃癌細胞增殖、遷移的影響觀察

1.3.1 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。將胃癌細胞系A(chǔ)GS傳代接種至6孔板，調(diào)整細胞密度為1×105～5×105/孔，隨機分為丁酸鹽組和空白對照組。丁酸鹽組分別加入終濃度為0.5、1.0、2.5 mmol/L的丁酸鹽，空白對照組未予特殊處理，作用24 h。將兩組細胞按3×103～5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔。每孔加入完全培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，接種孔四周加入PBS 100 μL。兩組分別于培養(yǎng)0、12、24、48 h向孔中加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值，以此表示細胞增殖能力。

1.3.2 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實驗。將胃癌細胞系A(chǔ)GS傳代接種至6孔板，調(diào)整細胞密度為1×105～5×105/孔，隨機分為丁酸鹽組和空白對照組。丁酸鹽組加入終濃度為2.5 mmol/L的丁酸鹽，空白對照組未予特殊處理，作用24 h。收集兩組細胞，重懸于無血清培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞密度為1×105/100 μL。于Transwell小室上室加入細胞懸液100 μL、含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液200 μL，下室加入含10%～20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液600 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出孔板，常規(guī)進行固定、染色，顯微鏡下對進入下室的細胞進行計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 幽門螺桿菌組與對照組胃內(nèi)常見微生物菌群豐度情況 幽門螺桿菌組胃內(nèi)的微生物菌群按照豐度排序依次為：幽門螺旋桿菌(0.908 5±0.119 6)lg cfu/mg，柔嫩梭菌(0.763 4±0.108 5)lg cfu/mg，擬球梭菌(0.759 7±0.102 4)lg cfu/mg，乳酸菌(0.748 2±0.094 6)lg cfu/mg，普氏菌(0.690 2±0.040 3)lg cfu/mg。對照組胃內(nèi)的微生物菌群按照豐度排序依次為：擬球梭菌(0.724 2±0.175 5)lg cfu/mg，乳酸菌(0.722 6±0.115 9)lg cfu/mg，腸桿菌(0.707 5±0.093 3)lg cfu/mg，柔嫩梭菌(0.705 8±0.082 5)lg cfu/mg。

2.2 幽門螺桿菌組與對照組胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平比較 幽門螺桿菌組灌胃后6個月胃組織丁酸水平高于對照組(P<0.05)。與灌胃后6個月比較，幽門螺桿菌組與對照組灌胃后12個月胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平均升高，且幽門螺桿菌組升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 幽門螺桿菌組與對照組胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平比較

注：與同組灌胃后6個月比較，*P<0.05；與對照組同時間點比較，#P<0.05。

2.3 丁酸鹽組與空白對照組細胞增殖能力比較 與對照組同時間點比較，加入不同濃度丁酸鹽的丁酸鹽組作用24、48 h的OD值均升高(P均<0.05)。相同作用時間下，丁酸鹽組OD值隨著丁酸鹽濃度的升高而升高，以2.5 mmol/L作用48 h時的OD值最高(P均<0.05)。見表2。

表2 丁酸鹽組與空白對照組細胞增殖能力比較

注：與空白對照組同時間點比較，*P<0.05；與加入0.5 mmol/L丁酸鹽的丁酸鹽組比較，#P<0.05；與加入1.0 mmol/L丁酸鹽的丁酸鹽組比較，△P<0.05。

2.4 丁酸鹽組與空白對照組細胞遷移能力比較 丁酸鹽組與空白對照組進入下室的細胞數(shù)分別為(221±32)、(85±14)個，兩組比較P<0.05。

3 討論

胃內(nèi)微生態(tài)是胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)中的一個獨特區(qū)域，幽門螺桿菌的存在可影響其微生物菌群組成，但組成成分的改變?nèi)跃哂袪幾h性。既往研究顯示，幽門螺桿菌陰性個體中最豐富的菌群依次是鏈球菌、乳酸桿菌、韋榮菌、普氏菌[3]，而幽門螺桿菌陽性個體中最豐富的菌群依次是幽門螺桿菌、變形桿菌、厚壁菌、放線菌[4]。幽門螺桿菌陽性可導(dǎo)致變形桿菌、螺旋菌及酸類桿菌豐度升高[5]。Andersson等[2]發(fā)現(xiàn)，在幽門螺桿菌陽性個體中，幽門螺桿菌占胃內(nèi)微生物菌群的70%～95%。本研究結(jié)果顯示，幽門螺桿菌組灌胃后12個月胃內(nèi)微生物菌群按照豐度排序依次是幽門螺旋桿菌、柔嫩梭菌、擬球梭菌、乳酸菌、普氏菌，對照組依次是擬球梭菌、乳酸菌、腸桿菌、柔嫩梭菌，說明幽門螺桿菌感染會引起大鼠胃內(nèi)微生物菌群改變。

細菌的代謝產(chǎn)物可作為腫瘤細胞能量代謝的原料，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸及丁酸等，由細菌發(fā)酵碳水化合物衍生而來。丁酸是膳食纖維經(jīng)胃腸道細菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，屬于短鏈脂肪酸的一種，是體內(nèi)丁酸鹽的主要有效成分。能夠產(chǎn)生丁酸的微生物統(tǒng)稱為丁酸鹽產(chǎn)生菌，主要由厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、梭菌門、螺旋體門等微生物組成[7]。腸道內(nèi)產(chǎn)丁酸鹽的細菌主要分布在厚壁菌門梭菌科中的梭菌屬，其中豐度最高的是柔嫩梭菌，其次是擬球梭菌[6]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽可通過調(diào)節(jié)Treg細胞、NF-κB通路而影響炎癥反應(yīng)，參與維持腸道上皮細胞完整性及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[8]。Belcheva等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)可以通過產(chǎn)生丁酸鹽，刺激結(jié)腸上皮細胞增殖、分化，從而導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生。Qin等[10]采用16 S rRNA高通量測序方法發(fā)現(xiàn)，當腸道丁酸鹽產(chǎn)生菌增多以及菌群活動增強時，易誘發(fā)機體發(fā)生胰島素抵抗，從而導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。目前，大部分研究是關(guān)于丁酸鹽對結(jié)腸上皮細胞的影響，且結(jié)果具有爭議性[11,8]。丁酸鹽理論上可作為氧化能量和胃酸分泌過程中的氧化代謝來源[12]，但是目前關(guān)于丁酸鹽是否存在于胃黏膜上皮及其對胃癌發(fā)生的影響鮮見報道。本研究結(jié)果顯示，幽門螺桿菌組灌胃6個月胃組織丁酸水平即開始升高，灌胃12個月胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平均高于對照組，其中丁酸水平升高最明顯；這與幽門螺桿菌組灌胃12個月丁酸鹽產(chǎn)生菌(柔嫩梭菌、擬球梭菌)豐度升高的結(jié)果相符合，提示微生物菌群豐度改變勢必導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)物的變化。

目前，關(guān)于丁酸鹽對消化道腫瘤細胞增殖能力影響的研究多集中于結(jié)腸癌細胞，且其影響存在爭議。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽可通過增強miR-200c表達而抑制結(jié)腸腫瘤細胞增殖能力。Singh等[14]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽可激活Gpr109a，從而抑制結(jié)腸炎癥及結(jié)腸癌進展。Donohoe等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響取決于其濃度，在較低劑量(0.5、1.0 mmol/L)時丁酸鹽能夠促進結(jié)腸癌細胞增殖，而在高劑量(>1.0 mmol/L)時則呈現(xiàn)抑制作用。本研究結(jié)果顯示，丁酸鹽可促進胃癌細胞增殖和遷移，且在濃度為2.5 mmol/L時促增殖能力最強。

綜上所述，幽門螺桿菌感染可以導(dǎo)致小鼠胃組織中丁酸水平及產(chǎn)丁酸鹽的菌群豐度升高，而丁酸鹽可促進胃癌細胞增殖、遷移，這可能是幽門螺桿菌導(dǎo)致胃癌發(fā)生的機制之一。但本研究樣本量較小，尚需進一步擴大實驗標本、增加胃內(nèi)微生物菌群構(gòu)建數(shù)量及種類，為研究幽門螺桿菌對胃內(nèi)微生態(tài)及微生物代謝組學(xué)的影響提供依據(jù)。