趙亞運(yùn)，張墨軒，潘景臻，司茂飛，趙志明，張健

1山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東泰安271000；2臨沂市人民醫(yī)院；3濰坊醫(yī)學(xué)院

腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的常見(jiàn)原發(fā)性腦腫瘤，占大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的30%，并且以多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)為主，患者的中位生存期不到15個(gè)月[1,2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，O-6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)啟動(dòng)子甲基化、IDH基因變異、染色體1p/19q共缺失、TERT啟動(dòng)子變異等均有助于腦膠質(zhì)瘤的臨床診斷、預(yù)后及化療敏感性判斷，但其敏感度和準(zhǔn)確度有限[3,4]。細(xì)胞周期蛋白B2(CCNB2)屬于B型細(xì)胞周期家族蛋白，位于染色體15q22.2，與細(xì)胞周期依賴(lài)型激酶(CDKS)結(jié)合調(diào)節(jié)CDKS活性，不同的細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期的特定階段具有時(shí)空特性[5]。CCNB2通過(guò)激活細(xì)胞分裂周期蛋白激酶2(CDK2)，參與真核細(xì)胞周期中的G2/M期轉(zhuǎn)化。研究表明，CCNB2過(guò)表達(dá)與結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6～8]，但其在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。為此，我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年6月～2014年6月于臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)外科首次接受手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者65例作為觀察組，男32例、女33例，年齡4～70歲、中位年齡44歲；腫瘤部位：額葉40例，顳葉16例，其他9例；KPS評(píng)分：<80分34例，≥80分31例；WHO分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)31例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)34例；腫瘤直徑：<4 cm 21例，≥4 cm 44例；p53基因型：野生型38例，突變型27例；Ki-67表達(dá)：陽(yáng)性27例，陰性38例?；颊呔?jīng)術(shù)后病理證實(shí)；排除術(shù)前行放療、化療及免疫治療者，合并心、肝、腎等功能不全者，合并其他腫瘤者，腫瘤直徑太小無(wú)法獲取標(biāo)本者。選擇同期因顱腦外傷行顱內(nèi)減壓手術(shù)的患者30例作為對(duì)照組，男15例、女15例，年齡5～70歲、中位年齡44歲。兩組性別、年齡均具有可比性。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者或其家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 腦組織CCNB2檢測(cè)方法 采用免疫組化法。觀察組術(shù)中收集腦膠質(zhì)瘤組織，對(duì)照組術(shù)中收集切除的腦組織。將兩組腦組織進(jìn)行石蠟包埋，4 μm厚度切片，70 ℃烤箱中烘烤1 h，二甲苯脫蠟，順濃度梯度乙醇水化。將脫蠟水化后的切片置于10 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH值為6.0)中，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。滴加阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗2 min×3次；滴加CCNB2抗體(1∶100)，37 ℃條件下孵育3 h，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加抗鼠/兔IgG二抗，室溫下孵育20 min，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。加入適量新鮮配制的二氨基苯胺(DAB)，室溫暗箱孵育3～5 min，加水終止顯色。流動(dòng)水沖洗，蘇木素、鹽酸乙醇分化液和氨水返蘭復(fù)染，脫水、透明、封片后顯微鏡觀察。免疫組學(xué)分析和評(píng)分均由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立完成，以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽(yáng)性染色，根據(jù)染色強(qiáng)度(0～3級(jí))和陽(yáng)性細(xì)胞比例(0～100%)進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度0級(jí)評(píng)分為0分，染色強(qiáng)度2級(jí)、陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%評(píng)分為2分，染色強(qiáng)度1級(jí)、陽(yáng)性細(xì)胞比例>50%評(píng)分為3分，染色強(qiáng)度2級(jí)、陽(yáng)性細(xì)胞比例10%～50%評(píng)分為4分，染色強(qiáng)度2級(jí)、陽(yáng)性細(xì)胞比例>50%評(píng)分為5分，染色強(qiáng)度3級(jí)、陽(yáng)性細(xì)胞比例100%評(píng)分為6分。評(píng)分>4分定義為CCNB2陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 隨訪方法 觀察組術(shù)后隨訪記錄生存時(shí)間，生存時(shí)間定義為從診斷之日起至腦膠質(zhì)瘤相關(guān)死亡的時(shí)間間隔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的生存曲線，生存時(shí)間比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腦組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)率比較 觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)率為50.8%(33/65)，對(duì)照組腦組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%(5/30)，兩組比較P<0.01。

2.2 觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)與患者WHO分級(jí)、p53基因型、Ki-67表達(dá)均有關(guān)(P均<0.05)。觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤位置、KPS評(píng)分、腫瘤直徑均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)患者生存時(shí)間為(44.0±5.7)月，陰性表達(dá)患者為(81.0±6.4)月，兩者比較P<0.01。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因很多，腦內(nèi)遺傳因素和殘留的胚胎原始細(xì)胞是導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要內(nèi)源性影響因素，有害的理化因素以及病毒感染則是外源性因素。目前腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，Rb、p53和受體酪氨酸激酶(RTK)信號(hào)通路等在腦膠質(zhì)瘤尤其在GBM的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[9]，調(diào)控這些通路的基因和蛋白不僅可以作為腦膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物，還可以用來(lái)評(píng)估腦膠質(zhì)瘤的病理特征。B型細(xì)胞周期蛋白家族包括CCNB1和CCNB2。在分裂間期，CCNB1持續(xù)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間穿梭；在分裂間期末，CCNB1快速進(jìn)入細(xì)胞核，并與有絲分裂體結(jié)合；與之相反，在分裂間期和有絲分裂期，CCNB2會(huì)穿出細(xì)胞核，逐漸靠近高爾基體。盡管CCNB1和CCNB2在細(xì)胞內(nèi)的定位不同，但是兩者共同發(fā)揮促使細(xì)胞進(jìn)入G2/M期的重要功能。CCNB2與CDK2相互作用，形成絲氨酸/蘇氨酸激酶合酶復(fù)合物，稱(chēng)為成熟促進(jìn)因子(MPF)。CCNB2在G1期合成，一般通過(guò)激活CDK2激酶觸發(fā)G2/M轉(zhuǎn)化，然后在前中期和后期表達(dá)迅速下降，抑制CCNB2表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[10]。在正常情況下，CCNB2表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，但在一些惡性細(xì)胞中CCNB2降解受到抑制，導(dǎo)致CCNB2過(guò)表達(dá)，CCNB2的異常表達(dá)可導(dǎo)致G2/M期調(diào)節(jié)點(diǎn)修復(fù)受損DNA和維持基因組完整的功能失常，由此導(dǎo)致基因突變和腫瘤發(fā)生[10]。

表1 觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

研究表明，CCNB2在胃癌、上皮性卵巢癌和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中表達(dá)上調(diào)[11～13]。與正常對(duì)照組相比，肺癌和消化道腫瘤患者血清CCNB2 mRNA表達(dá)升高，并與癌癥分期和轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)[14]。有研究基于KEGG、PPI網(wǎng)絡(luò)和WGCNA分析中的重復(fù)基因，篩選出CCNB2可作為腦膠質(zhì)瘤的候選診斷標(biāo)記基因[15]。研究表明，在腦膠質(zhì)瘤組織和星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中CCNB2 mRNA和蛋白表達(dá)均升高[16]。本研究顯示，觀察組腦膠質(zhì)瘤組織中CCNB2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，表明CCNB2表達(dá)升高可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生。Ki-67是一種存在于增殖細(xì)胞的核抗原，表達(dá)于細(xì)胞周期的G1/M期，在G0期表達(dá)受到抑制，是細(xì)胞進(jìn)入增殖周期的標(biāo)志物。 Ki-67是應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)志物之一，Ki-67陽(yáng)性率越高表明處于增殖周期的細(xì)胞越多，腫瘤生長(zhǎng)越快，組織分化越差。p53可分為野生型和突變型，野生型p53是一種快速誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡的抑癌基因，可防止具有潛在癌變潛能的細(xì)胞發(fā)生癌變，發(fā)揮抗癌作用。野生型p53一旦發(fā)生突變，就不再具有抑瘤作用，反而會(huì)加速癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。當(dāng)野生型p53轉(zhuǎn)化為突變型p53時(shí)，突變型p53作為原癌基因在腫瘤細(xì)胞中長(zhǎng)期存在，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)與患者WHO分級(jí)、p53基因型、Ki-67表達(dá)均有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤位置、KPS評(píng)分、腫瘤直徑均無(wú)關(guān)，且CCNB2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤增殖指標(biāo)Ki-67及突變型p53表達(dá)有關(guān)，提示CCNB2在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促瘤作用。

Shubbar等[8]研究表明，CCNB2蛋白過(guò)表達(dá)與乳腺癌患者的短期疾病特異性生存(DSS)密切相關(guān)，是乳腺癌患者DSS的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。Takashima等[17]研究表明，CCNB2 mRNA高表達(dá)的肺腺癌患者總體生存率低于CCNB2 mRNA低表達(dá)者。還有研究表明，CCNB2過(guò)表達(dá)提示非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良[7]。本研究結(jié)果顯示，觀察組腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2陽(yáng)性表達(dá)患者生存時(shí)間明顯短于陰性表達(dá)患者，說(shuō)明腦膠質(zhì)瘤組織CCNB2表達(dá)升高提示患者生存時(shí)間短、預(yù)后較差。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織中CCNB2蛋白表達(dá)升高，CCNB2蛋白表達(dá)升高可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展，并提示患者預(yù)后不良。