霍穎玙，馮儒志，黃洲明，李 勇，周宗艾，邱樹毅

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.海南正生堂食品科技有限公司，海南?？?570216；4.貴州仁懷宏盛酒業(yè)有限公司，貴州仁懷 564501）

酒曲在白酒釀造過程中起著至關(guān)重要的作用。中國的醬香型白酒制曲工藝是高溫制曲，“高溫”的特點同時也加速了化學(xué)反應(yīng)、生物化學(xué)反應(yīng)、褐變反應(yīng)與美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，生成了大量的香氣成分。這使得釀造出的白酒醬香風(fēng)味濃郁。

高溫大曲中芽孢桿菌的數(shù)量占很大的比例[1]。芽孢桿菌在醬香型白酒生產(chǎn)過程中擔(dān)任著產(chǎn)香功能細(xì)菌的角色，它可以分泌如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等豐富的酶系，這些酶系推動了小麥，高粱等原料分解，形成豐富的氨基酸與糖類，從而促進(jìn)醬香風(fēng)味的生成[2-3]。利用純培養(yǎng)技術(shù)，將功能性細(xì)菌加入制曲過程中進(jìn)行培養(yǎng)，制作功能性強化大曲，可以達(dá)到豐富風(fēng)味物質(zhì)以及提高白酒風(fēng)味質(zhì)量的目的。孟天毅等[4-5]對生產(chǎn)車間的強化高溫大曲進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，強化大曲中的微生物與成品曲基本一致，且強化大曲的醬香風(fēng)味更加突出，而成品曲則是曲香突出；強化大曲產(chǎn)酒醬香更加濃郁、酒體爽凈，而成品曲則顯得更加豐滿、醇厚。楊濤等[6]將醬香大曲中所分離到的地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等按一定比例混合制成三級種子液，后在拌料階段加入到制曲過程，試驗所得強化大曲的液化力、蛋白質(zhì)水解力均有明顯提高，并且大曲中游離氨基酸含量有所增加，運用到釀酒階段時，糟醅的各項理化指標(biāo)均有提升，釀制酒液的品質(zhì)優(yōu)良。

酵母菌有利于白酒的呈香作用[8-11]。但在高溫制曲過程中，由于溫度的升高不利于酵母菌的生長。王曉丹等[7]曾在醬香型白酒的酒醅中篩選出畢赤酵母，并發(fā)現(xiàn)其擁有較強的產(chǎn)酒產(chǎn)酯能力。所以，對于制作強化曲來說，如何將功能芽孢桿菌與功能酵母菌同時利用到強化曲的制作中，豐富強化曲的風(fēng)味物質(zhì)，提高酒曲的品質(zhì)至關(guān)重要[12-18]。同時研究在酒曲制作過程中芽孢桿菌與酵母菌的相互作用，以及有益代謝物的產(chǎn)生可以幫助我們更好的了解微生物之間在酒曲發(fā)酵過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種

地衣芽孢桿菌、畢赤酵母均由本課題組從貴州茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒生產(chǎn)用曲中分離篩選得到。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

干酪素（分析純）、無水碳酸鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純），天津市海光化學(xué)試劑廠；福林酚（分析純），北京索萊寶生物科技有限公司；三氯乙酸（分析純）、冰乙酸（分析純）、乙酸鈉（分析純），重慶北碚精細(xì)化工廠；磷酸氫二鉀（分析純），成都市科龍化工試劑廠。

YEPD培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于化學(xué)試劑商店。

小麥粉培養(yǎng)基：5 g 小麥粉中加入100 mL 水，振蕩混勻，自然pH，121 ℃滅菌20 min。小麥粉，山東楊湖酒業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；Stable Flex 纖維頭（DVB/CAR/PDMS），美國Supelco 公司；7890A-5975C 氣相色譜質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；FA1004 電子天平，上海箐海儀器有限公司；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備

畢赤酵母種子液：從PDA 培養(yǎng)基中挑取1 環(huán)活化好的酵母菌菌苔于YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

地衣芽孢桿菌種子液：從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑取1 環(huán)活化好的芽孢桿菌菌苔于LB 培養(yǎng)基中，以37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.2 芽孢桿菌對酵母細(xì)胞生長的影響

選取葡萄糖、蛋白胨和地衣芽孢桿菌發(fā)酵液作為組分，設(shè)計培養(yǎng)基如表1 所示。取0.5 mL 酵母種子液加入2 mL 無菌離心管中，于8000 r/min 離心10 min，去除上清液，并在沉淀中加入0.2 mL 無菌水，混勻后全部接入50 mL 酵母生長培養(yǎng)基中（接種量1%），于180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，并測定生物量。

表1 酵母生長培養(yǎng)基

1.2.3 地衣芽孢桿菌與畢赤酵母共培養(yǎng)研究

取1.0 mL 酵母或0.5 mL 芽孢桿菌種子液加入2 mL 無菌離心管中，于8000 r/min 離心10 min，去除上清液，并在沉淀中加入0.2 mL無菌水，混勻后全部接入50 mL小麥粉培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每24 h取樣用于測定菌落數(shù)。

1.2.4 畢赤酵母與地衣芽孢桿菌制作強化曲研究

畢赤酵母與地衣芽孢桿菌不同比例下混合發(fā)酵。地衣芽孢桿菌與畢赤酵母以1∶0.1、1∶0.5、1∶1、1∶5、1∶10 的接種比例同時接種于小麥固態(tài)培養(yǎng)基。接種后地衣芽孢桿菌的數(shù)量為5×106CFU/g，放于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.5 樣品生物量測定

稱取10 g 樣品放于盛有90 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩30 min，取1 mL 充分稀釋，吸取稀釋液涂布于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)計數(shù)。

1.2.6 粗酶液的制備及酶活測定

250 mL 三角瓶中加入10 g 樣品，再加100 mL蒸餾水，在40 ℃的條件下水浴1 h，每15 min 攪拌1次，然后用定性濾紙過濾，將開始的5 mL 棄去，之后過濾濾液為測定酶活所需的粗酶液。

酸性蛋白酶活力檢測：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》對樣品的酸性蛋白酶進(jìn)行測定。

淀粉酶活力檢測：采用改良Young J.Yoo 法[19]。

1.2.7 大曲理化指標(biāo)的測定

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的測定方法對大曲水分、淀粉、酸度、液化力、糖化力、酯化力、發(fā)酵力進(jìn)行測定。

1.2.8 GC-MS分析實驗

采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）技術(shù)結(jié)合GC-MS分析麥曲中揮發(fā)性成分[20-22]。

樣品處理：取麥曲粉0.2 g加入5 mL水中，超聲波處理30 min。GC-MS 條件：安捷倫6890N 氣相色譜配備5975 質(zhì)譜儀。毛細(xì)管柱DB-Wax(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm)，進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250 ℃，載氣為He，流速2 mL/min。程序升溫：起始溫度50 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的升溫速率升溫到85 ℃，保留0.1 min，再以5 ℃/min 的升溫速率升溫到230 ℃，保持2 min。電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃。質(zhì)譜分析用數(shù)據(jù)庫為Wiley275.L(Agilent公司)和NIST庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌對酵母菌生長影響情況（表2）

表2 畢赤酵母的生物量情況

根據(jù)表2 可知，地衣芽孢桿菌FBKL1.0199 對所選酵母的生長無抑制作用。畢赤酵母在只有地衣芽孢桿菌發(fā)酵上清液的培養(yǎng)基中有微弱的生長能力，但加入微量的葡萄糖和蛋白胨后生長能力獲得了極大的提高，菌落總數(shù)從之前的不足103CFU/mL增加到1.45×107CFU/mL，除此之外，葡萄糖的添加也對畢赤酵母的生長有促進(jìn)作用。在只有蛋白胨和發(fā)酵液的培養(yǎng)基中畢赤酵母的菌落總數(shù)小于104CFU/mL，而在此培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了葡萄糖后，菌落總數(shù)增加到1.45×107CFU/mL。而且在只有葡萄糖的培養(yǎng)基中，畢赤酵母的菌落總數(shù)可達(dá)到3.3×106CFU/mL，添加微量氮源可以使酵母數(shù)量增加。由此可知，即使有地衣芽孢桿菌的存在，只要提供了畢赤酵母生長的營養(yǎng)成分，酵母還是可以很好的生長。

2.2 地衣芽孢桿菌與畢赤酵母共培養(yǎng)規(guī)律研究（圖1）

在混培養(yǎng)體系中，畢赤酵母的最高生物量均在發(fā)酵中期，為2.96×109CFU/mL。畢赤酵母數(shù)量在培養(yǎng)的前72 h 內(nèi)持續(xù)增加，之后便持續(xù)下降，在發(fā)酵終點畢赤酵母數(shù)量為1.14×109CFU/mL。發(fā)酵24 h 時，在混酵體系中畢赤酵母比例為16.87%，發(fā)酵中期畢赤酵母比例可上升到31%～34%，發(fā)酵終點時畢赤酵母比例又降到了12.33%?？梢?，在混培養(yǎng)體系中，畢赤酵母與地衣芽孢桿菌的混酵過程以地衣芽孢桿菌的增殖為主。在混培養(yǎng)體系中，畢赤酵母菌與地衣芽孢桿菌可以共同培養(yǎng)，地衣芽孢桿菌的增殖速度大于畢赤酵母菌的增長速度。同時研究表明，在小麥粉與水組成的小麥粉培養(yǎng)基中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母不存在明顯的相互抑制的情況，所以可以將其利用于強化麥曲的制備，以達(dá)到提高麥曲品質(zhì)的目的。

2.3 強化曲發(fā)酵過程中畢赤酵母與地衣芽孢桿菌生物量的變化（圖2、圖3）

地衣芽孢桿菌在發(fā)酵過程中一直呈生長優(yōu)勢，每隔2 d 以102左右的生長速率增長。在不添加畢赤酵母的實驗組中，發(fā)酵14 d 以后，樣品的地衣芽孢桿菌菌落總數(shù)可達(dá)到1.1×1017CFU/g。除此之外，在地衣芽孢桿菌與畢赤酵母以1∶10 的接種比例接種的實驗組中，同樣在發(fā)酵14 d 以后，地衣芽孢桿菌菌落總數(shù)可達(dá)到5.6×1016CFU/g。由此可知，添加畢赤酵母對地衣芽孢桿菌生長情況影響不大，地衣芽孢桿菌仍為混合培養(yǎng)體系中的優(yōu)勢菌。畢赤酵母在混合體系中培養(yǎng)的14 d 內(nèi)，酵母菌總數(shù)始終維持在108～109CFU/g?；旌象w系發(fā)酵前期，生長速率較緩慢，在中期加速增長，發(fā)酵后期生長速率減慢，這可能是因為在發(fā)酵前期，小麥中的營養(yǎng)物質(zhì)畢赤酵母還不能直接應(yīng)用，所以酵母生長速度緩慢。但是隨著地衣芽孢桿菌的生長，其代謝出來的酶將小麥中淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)分解成畢赤酵母可利用的糖類物質(zhì)，滿足酵母的生長條件，故而在中期生長迅速。在發(fā)酵后期由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用減少，生長速率也慢慢減少了下來。所以在混合培養(yǎng)體系中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母都可增長，地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酶能力，對畢赤酵母的生長也有益處。所以，在強化曲的制作過程中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母都有一定的生物量，他們的生長對各種代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生提供了可能。

2.4 發(fā)酵過程中混合體系酶活變化情況（圖4、圖5）

如圖4、圖5 所示，對照組為只添加芽孢桿菌的純培養(yǎng)發(fā)酵體系。在不同比例的混合發(fā)酵體系中，地衣芽孢桿菌迅速生長，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物。其中在發(fā)酵前8 d，酸性蛋白酶的酶活快速增加。在這之后增長速度減小，最后曲線趨于平穩(wěn)。在發(fā)酵結(jié)束時，酸性蛋白酶的酶活可達(dá)到1100～1300 U。添加酵母比例大的樣品，在發(fā)酵前4 d時，酸性蛋白酶活遠(yuǎn)低于添加酵母比例小的樣品。但在發(fā)酵后期，酶活迅速增長，最后與對照組相差不大。發(fā)酵前期，大量的酵母菌占據(jù)了生長優(yōu)勢，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，地衣芽孢桿菌的迅速增長，進(jìn)而產(chǎn)生了更多的代謝產(chǎn)物，提高了酶活。而且，與對照組相比，酶活的變化趨勢并沒有太大的差異。酵母菌的添加對酸性蛋白酶酶活的影響并不大。同樣，對于淀粉酶的生長情況也沒有太大的影響。淀粉酶酶活在發(fā)酵期的前8 d 迅速增長，發(fā)酵到第8～10 天時酶活趨于平穩(wěn)，第10 天至發(fā)酵結(jié)束淀粉酶活緩慢降低，在發(fā)酵結(jié)束時，淀粉酶酶活可達(dá)到530～630 U?？梢?，地衣芽孢桿菌在混培養(yǎng)體系中可以不受酵母菌生長的影響，產(chǎn)生有利于小麥分解的酸性蛋白酶與淀粉酶。

2.5 麥曲的理化指標(biāo)檢測結(jié)果（表3）

不同接種比例的強化曲酸度變化不大。其中酸度最高的為接種比例為1∶5 時，達(dá)到3.3。接種比例為1∶0.5 時的樣品酸度值最小，為2.5。只添加細(xì)菌發(fā)酵的對照組酸度值可達(dá)到3.79，而只添加酵母菌發(fā)酵的對照組酸度值僅有0.37，傳統(tǒng)大曲的酸度為1.39?？梢?，酵母菌并不會對強化曲的酸度有太大的影響，而且酵母菌的存在稍微降低了強化曲的酸度，但添加細(xì)菌制作的強化曲的酸度略大于傳統(tǒng)大曲的酸度。

淀粉的消耗與芽孢桿菌的添加相關(guān)。原料小麥中的淀粉含量為74.47 g/100 g，而強化曲的淀粉含量均在40.9～42.55 g/100 g。在只添加酵母菌的對照組中，淀粉含量為65.4 g/100 g，而只添加細(xì)菌發(fā)酵的對照組淀粉含量最少，為32 g/100 g。由此可見，芽孢桿菌越多對淀粉的消耗量越大。因為，芽孢桿菌可分解多種酶類，對原料淀粉進(jìn)行水解代謝成小分子產(chǎn)物，以便于微生物后續(xù)的發(fā)酵利用。

各個接種比例的強化曲糖化力都相差不大。只添加酵母發(fā)酵的強化曲未檢測出糖化力。而只添加細(xì)菌發(fā)酵的對照組糖化力最高為88U，其中傳統(tǒng)大曲的糖化力為268 U。所以，強化曲的糖化力主要來源于細(xì)菌的代謝作用。細(xì)菌除了代謝產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶以外，還會代謝產(chǎn)生糖化酶。故而，添加細(xì)菌發(fā)酵的強化曲有一定的糖化力，但糖化力不高。

在添加細(xì)菌發(fā)酵的強化曲中均有檢測出液化力，而只添加酵母菌發(fā)酵的對照組中，未檢測出液化力。且不同的接種比例的樣品，液化力并沒有太大的變化。其中傳統(tǒng)大曲的液化力為0.58，強化曲的液化力高于傳統(tǒng)大曲的液化力。酵母的添加對液化力沒有太大影響，細(xì)菌對強化曲的液化力有主要貢獻(xiàn)意義。

接種比例為1∶10 的樣品發(fā)酵力最高，為1.2。不同的接種比例之間，隨著酵母菌添加量的增加發(fā)酵力逐步上升。只添加細(xì)菌的對照組中發(fā)酵力最低，僅有0.68。而且，傳統(tǒng)大曲的發(fā)酵力為0.55，強化曲的發(fā)酵力高于傳統(tǒng)大曲。由此可知，強化曲的發(fā)酵力主要來源于酵母菌的生長。酵母菌有較強的產(chǎn)酒精能力、較高的耐酒精能力與耐酸能力。它在酒化酶的作用下可以將糖轉(zhuǎn)化為酒精。

表3 強化麥曲的理化指標(biāo)

當(dāng)接種比例為1∶10 時，強化曲的酯化力最高達(dá)到73.84。而不添加酵母以及添加酵母含量較低的樣品中酯化力均在33 以下。只添加酵母的對照組中酯化力為66.8，傳統(tǒng)大曲的酯化力為60.3，添加酵母菌制作的強化曲酯化力高于傳統(tǒng)大曲的酯化力。酵母菌的生長對酯化力有貢獻(xiàn)作用。酵母菌對酯、酸有酯化能力，可以形成大曲的酯類香氣。大量的酵母菌可以代謝產(chǎn)生酯化酶。而細(xì)菌可以代謝產(chǎn)生酸類物質(zhì)，給酵母菌提供原料，促進(jìn)酯化反應(yīng)。

綜上所述，對發(fā)酵結(jié)束后的幾組強化麥曲進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測分析，根據(jù)上表的數(shù)據(jù)可知，添加功能酵母發(fā)酵培養(yǎng)以后，對所得麥曲的酯化力有一定的提高作用，只添加細(xì)菌培養(yǎng)的麥曲酯化力為33.2 U，而添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵以后酯化力可以提高到73.84 U。對于發(fā)酵力而言，酵母的添加對麥曲的發(fā)酵力有提升，從不添加酵母的0.68 提升到1.2。而添加酵母幾乎對酸度、糖化力、液化力的理化指標(biāo)沒有什么影響。畢赤酵母的添加對強化曲的品質(zhì)影響隨著畢赤酵母添加量的增加而逐步增大，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母的混合比例1∶10 時制作出的強化麥曲的理化指標(biāo)影響效果較為明顯。

在初始含水量一致的情況下，隨著酵母菌添加量增加，水分含量會隨之小范圍降低。其中，僅添加酵母菌發(fā)酵的對照組水分含量最低，為35.06%，遠(yuǎn)低于只添加細(xì)菌發(fā)酵的對照組水分含量55.7%。強化曲的水分含量高于傳統(tǒng)大曲的水分含量。由于所檢測的傳統(tǒng)大曲是在白酒實際生產(chǎn)中所用的高溫大曲，而強化曲樣是在實驗室培養(yǎng)的，所以水分含量普遍偏高。

2.6 GC-MS風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果

將地衣芽孢桿菌與畢赤酵母混合比例為1∶10的發(fā)酵之后的麥曲樣品進(jìn)行HS-SPME 結(jié)合GCMS 分析。麥曲GC-MS 總離子圖見圖6。成分分析見圖7。

由圖6、圖7 可知，麥曲中共檢測到17 種物質(zhì)，醛類物質(zhì)1 種，醇類物質(zhì)4 種，酸類物質(zhì)2 種，吡嗪類物質(zhì)4 種，呋喃類物質(zhì)1 種，酚類物質(zhì)3 種，醚類物質(zhì)1 種，未檢測出酮類物質(zhì)。其中，吡嗪類物質(zhì)含量最高，可達(dá)到19.268%，以四甲基吡嗪為主，百分比含量為16.365%。

其次是醛類化合物，所占百分比含量為5.519%，其中以苯乙醛為主，所占百分比含量為5.281%。酸類物質(zhì)占總體風(fēng)味物質(zhì)的4.068%，醇類物質(zhì)的百分比含量為7.334%。

總體來說，此麥曲檢測出來風(fēng)味物質(zhì)較少，這可能是因為該強化曲的發(fā)酵過程全程是控制在雙菌發(fā)酵的。強化曲中菌落的單一性導(dǎo)致了風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生較少。但是，吡嗪類物質(zhì)的百分比含量較高，可達(dá)19.168%，吡嗪類物質(zhì)對白酒的醬香風(fēng)味是有貢獻(xiàn)意義的。除此之外，2,3-丁二醇不僅是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，又是重要的中間化合物前體，可氧化為3-羥基丁酮和2,3-丁二酮，同時這兩種物質(zhì)也是白酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)。高級醇苯乙醇和4-羥基-苯乙醇是白酒中助香劑和醇甜的主要成分，是白酒中風(fēng)味物質(zhì)。可見功能菌種的加入，對于豐富麥曲中的醬香風(fēng)味是有意義的。

3 結(jié)論

研究了在小麥培養(yǎng)基中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母的相互作用。設(shè)置了多個菌種混合比例，以不同的菌種添加比例去制作強化麥曲，研究可以提高強化麥曲的品質(zhì)的最佳接種比例，也跟蹤分析了在強化麥曲制作過程中微生物生物量，以及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生情況。畢赤酵母菌的存在并不會對地衣芽孢桿菌的生長產(chǎn)生影響。在強化麥曲的制作過程中，地衣芽孢桿菌的生長一直處于一個上升的趨勢，酵母菌的生長則處于一個先上升后降低的趨勢。對強化麥曲進(jìn)行GC-MS 風(fēng)味物質(zhì)分析可知，麥曲的風(fēng)味物質(zhì)雖然種類很少，但是在已檢測出來的風(fēng)味物質(zhì)中，吡嗪類物質(zhì)百分比含量最高，可達(dá)到19.268%，其中四甲基吡嗪百分比含量為16.365%。