張玲玲,李永玲,裴啟慧

(青海省西寧市第二人民醫(yī)院兒科，青海西寧 810003)

肺炎支原體在兒童中可引起高達40%的社區(qū)獲得性肺炎[1]。但到目前為止，因為它有一些不尋常的癥狀[2]，導(dǎo)致肺炎支原體感染的早期診斷成為一個難點。肺炎支原體感染的實驗室診斷基于血清學(xué)、培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)，但是它們各自都有特定的局限性[3]。SHI 等[4]通過噬菌體展示隨機肽文庫篩選了肺炎支原體的優(yōu)勢表位并獲得兩種七肽TVNFKLY和LPQRLRT。然而，噬菌體展示隨機肽文庫篩選的模擬表位可能不是病原體特異性，盡管它們具有各種肺炎支原體抗原同源性。因此，迫切需要對基于血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平的兒童肺炎支原體肺炎患兒診斷效能進行有效評估?；诖?，本研究旨在探討七肽TVNFKLY和LPQRLRT在兒童肺炎支原體肺炎中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2019年5月本院收治的兒童肺炎支原體肺炎患兒120例為支原體組；其中男66例，女54例，年齡2～10歲；平均(5.60±2.19)歲。非兒童肺炎支原體肺炎患兒120例為非支原體組；其中男63例，女57例，年齡2～11歲；平均(4.90±2.54)歲。兒童肺炎支原體肺炎患兒120例、非兒童肺炎支原體肺炎患兒120例均經(jīng)本院病理科依據(jù)《實用兒科學(xué)》確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；(2)長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者；(3)患有癌癥者。另選取同期本院體檢健康兒童120例為對照組；其中男64例，女56例，年齡2～11歲；平均(5.30±2.40)歲。各組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可納入此次分析。受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定試驗法(ELISA) 七肽TVNFKLY和LPQRLRT的抗體由Ontorespeptide公司合成。合成的anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT均為兔源，且能適用于ELISA法和蛋白質(zhì)免疫印跡法。采取兒童肺炎支原體肺炎患兒120例、非兒童肺炎支原體肺炎患兒120例和體檢健康兒童120例的肘前靜脈血5 mL，進行ELISA檢測(anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT)。

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡法 使用anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT抗體作為一抗、抗兔IgG為二抗(購自天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司，貨號：656120)。使用電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)[5]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用PRISM 7.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗。ImageJ軟件定量分析免疫印跡條帶。應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC曲線)的曲線下面積(AUC)分析七肽TVNFKLY和LPQRLRT檢測兒童肺炎支原體肺炎的臨床診斷價值。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組受試人員基礎(chǔ)臨床資料比較 兒童肺炎支原體肺炎患兒在年齡、男性比例、體質(zhì)量指數(shù)與非兒童肺炎支原體肺炎患兒比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。支原體組患兒在年齡、男性比例、體質(zhì)量指數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受試人員基礎(chǔ)臨床資料

2.2 各組受試人員血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比較 支原體組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的水平高于非支原體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非支原體組和對照組兒童血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比較

注：與非支原體組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

2.3 各組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白條帶比較 圖1、2中使用七肽TVNFKLY和LPQRLRT的抗體再采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組血清中的七肽TVNFKLY和LPQRLRT蛋白水平，支原體組蛋白條帶的灰度值明顯高于非支原體組與對照組，而非支原體組與對照組的蛋白條帶的灰度值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，支原體組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的整體蛋白水平高于非支原體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非支原體組和對照組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、2。

2.4 支原體組與對照組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值 為了評估血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT在支原體組與對照組診斷價值，繪制ROC曲線，見圖3。七肽TVNFKLY的AUC為[(0.92±0.02),95%CI0.890 3～0.963 6]，以七肽TVNFKLY的陽性臨界值為12.12 μg/mL，其診斷靈敏度為93%，特異度為90%；七肽LPQRLRT的AUC為[(0.91±0.01),95%CI0.873 2～0.953 3]，以七肽LPQRLRT的陽性臨界值為7.987 μg/mL，其診斷靈敏度為89%，特異度為92%。見表3。

圖1 各組血清中含七肽TVNFKLY蛋白條帶

2.5 七肽TVNFKLY和LPQRLRT聯(lián)合診斷兒童肺炎支原體肺炎 患有兒童肺炎支原體肺炎為真陽性，未患有兒童肺炎支原體肺炎為真陰性，以七肽TVNFKLY的陽性臨界值12.12 μg/mL，七肽LPQRLRT的陽性臨界值7.987 μg/mL為診斷界限，兩者均滿足則為聯(lián)合診斷陽性，反之則為聯(lián)合診斷陰性。血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT單向診斷兒童肺炎支原體肺炎的靈敏度分別為95.00%(114/120)和92.50%(111/120)，特異度分別為87.08%(209/240)和90.42%(217/240)，準(zhǔn)確度分別為89.72%(323/360)和91.11%(328/360)。血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT聯(lián)合對兒童肺炎支原體肺炎的診斷的靈敏度為92.50%(111/120)，特異度為90.83%(218/240)，準(zhǔn)確度為91.39%(329/360)。見表4。

圖2 各組血清中含七肽LPQRLRT的蛋白條帶

圖3 支原體組與對照組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的ROC曲線

表3 支原體組與對照組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的各指標(biāo)比較

表4 七肽TVNFKLY和LPQRLRT診斷兒童肺炎支原體肺炎(n)

3 討 論

肺炎支原體是導(dǎo)致兒童社區(qū)獲得性肺炎的最常見病原體之一[6-10]。雖然兒童肺炎支原體肺炎通常被認(rèn)為是一種自限性疾病，但有時它可能引起各種肺和肺外并發(fā)癥，如閉塞性細支氣管炎、壞死性肺炎、腦炎、關(guān)節(jié)炎、心包炎、溶血性貧血，并發(fā)展成嚴(yán)重的危及生命的肺炎。對于兒童，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物是兒童肺炎支原體感染的首選抗菌藥物。然而，盡管大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物治療7 d或更長時間，仍有一些病例顯示為難治性兒童肺炎支原體肺炎。因此，臨床醫(yī)生必須更早地識別兒童肺炎支原體肺炎并抓住合理治療的適當(dāng)機會。

本研究通過比較一般資料后通過ELISA檢測兒童肺炎支原體肺炎患兒、非兒童肺炎支原體肺炎患兒和體檢健康兒童血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平并評價其聯(lián)合診斷兒童肺炎支原體肺炎的價值，發(fā)現(xiàn)血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT聯(lián)合對兒童肺炎支原體肺炎的診斷的靈敏度為92.50%，特異度為90.83%，準(zhǔn)確度為91.39%。

使用噬菌體展示肽文庫技術(shù)篩選的模擬表位可以模擬線性表位和構(gòu)象表位，并且已經(jīng)廣泛用于許多疾病的診斷抗原或疫苗的開發(fā)，例如利什曼原蟲，戊型肝炎病毒，狂犬病病毒[11-15]。七肽TVNFKLY和LPQRLRT是由噬菌體展示肽文庫技術(shù)篩選的模擬表位。在本研究中，發(fā)現(xiàn)支原體肺炎患兒血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平高于非支原體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT單向診斷兒童肺炎支原體肺炎的靈敏度分別為95.00%和92.50%，特異度分別為87.08%和90.42%，準(zhǔn)確度分別為89.72%和91.11%。七肽TVNFKLY與肺炎支原體的21種蛋白質(zhì)具有高度同源性[4]，包括腺嘌呤特異性甲基轉(zhuǎn)移酶、α/β水解酶、ATP依賴性伴侶ClpB、金屬依賴性磷酸水解酶。同時，七肽LPQRLRT與8種肺炎支原體蛋白具有高度同源性，包括蘇氨酸-tRNA連接酶、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、ATP結(jié)合蛋白。提示七肽TVNFKLY和LPQRLRT具有較高的靈敏度和特異度，對肺炎支原體感染的血清學(xué)診斷均具有臨床價值。

在本研究中，支原體組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白水平高于非支原體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非支原體組和對照組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。盡管兒童肺炎支原體肺炎患兒血清中用anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT檢測到的蛋白質(zhì)水平遠遠高于非支原體組和對照組，但是非支原體組和對照組的免疫印跡結(jié)果依舊有少許其他蛋白的存在。引起這現(xiàn)象的原因可能有兩點：(1)本研究所使用的抗體可能特異性不高；(2)人類血清中可能含有TVNFKLY和LPQRLRT表位的非肺炎支原體蛋白質(zhì)。

4 結(jié) 論

綜上所述，血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平檢測可作為診斷兒童肺炎支原體肺炎的潛在標(biāo)志。