王 艷,任 娜,張 偉,蔡艷英,劉 穎,胡立新,李文瑄,宋文琪

(國家兒童醫(yī)學(xué)中心/首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心，北京 100045)

隨著實(shí)驗(yàn)室硬件設(shè)施和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理水平的提升，臨床、患者及實(shí)驗(yàn)室工作人員對(duì)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度的要求也在不斷提高。在臨床反饋不滿意的檢驗(yàn)結(jié)果中，經(jīng)追蹤調(diào)查60%～80%為標(biāo)本質(zhì)量不符合要求[1]。因此在分析前確保標(biāo)本質(zhì)量符合要求尤為重要。在實(shí)驗(yàn)室最為理想的情況是標(biāo)本接收后及時(shí)處理并檢測(cè)，以期待檢測(cè)結(jié)果能最貼近患者體內(nèi)真實(shí)水平。但在儀器發(fā)生故障、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)或樣本量少、等待批量檢測(cè)過程中均需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行暫時(shí)保存。選擇適當(dāng)?shù)谋４娣绞绞潜ＷC標(biāo)本質(zhì)量的關(guān)鍵。而國內(nèi)外對(duì)標(biāo)本保存方式評(píng)估分析結(jié)果不盡相同。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室常見的室溫、冰箱冷藏和冰箱凍存3種標(biāo)本保存條件下常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 室溫與冰箱冷藏標(biāo)本制備與檢測(cè) 2016年7月32名科室工作人員作為志愿者，在清晨空腹抽取靜脈血，每人抽取10 mL，分2支于含分離膠促凝管中。室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min后上機(jī)檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果作為0 h時(shí)結(jié)果。之后將標(biāo)本加蓋分別置于室溫24～25 ℃和2～8 ℃冰箱冷藏環(huán)境，并于2、4、6和8 h后分別檢測(cè)，并記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.1.2 -80 ℃冰箱凍存標(biāo)本制備與檢測(cè) 2019年4月選取兒童生化檢測(cè)后無溶血、乳糜標(biāo)本，將同一年齡兒童血清標(biāo)本進(jìn)行混合，每支混合血清不少于8 mL，共制備第一批混合血清標(biāo)本22支。將22支標(biāo)本充分混勻后，每支分裝為8份于標(biāo)本保存管內(nèi)，取一份當(dāng)時(shí)進(jìn)行生化檢測(cè)，其余7份于-80 ℃凍存，之后每隔1周取1份進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)上次第1批標(biāo)本留存1周后，按上面同樣方法留存第2批標(biāo)本，并按同樣方式進(jìn)行凍存和檢測(cè)。之后間隔1周再留存檢測(cè)第3批標(biāo)本。3批標(biāo)本均保持在同一天下午檢測(cè)，且采用同一瓶檢測(cè)試劑，同一臺(tái)設(shè)備。

1.2 儀器與質(zhì)控 冰箱冷藏和室溫保存標(biāo)本檢測(cè)采用AU2700全自動(dòng)生化分析儀，-80 ℃冷凍保存標(biāo)本檢測(cè)采用AU5821全自動(dòng)生化分析儀。室內(nèi)質(zhì)量控制品均采用伯樂質(zhì)控品，檢測(cè)前后均運(yùn)行質(zhì)控品且質(zhì)控結(jié)果在控。

1.3 方法 鉀(K)、鈉(NA)、氯(CL)采用離子選擇電極法進(jìn)行檢測(cè)；堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、L-γ- 谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(HBDH)、肌酸激酶(CK)、膽堿酯酶(CHE)采用速率法進(jìn)行檢測(cè)；肌酐(CR)、游離脂肪酸(NEFA)采用酶法進(jìn)行檢測(cè)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用直接法進(jìn)行檢測(cè)；總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、尿素(UREA)、尿酸(UA)分別采用雙縮脲法、溴甲酚綠法、脲紫外速率法、酶比色法進(jìn)行檢測(cè)；鈣(CA)、磷(P)、鎂(MG)分別采用偶氮砷三法、磷鉬酸比色法、二甲苯胺藍(lán)法進(jìn)行檢測(cè)；膽固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、葡萄糖(GLU)分別采用膽固醇氧化酶法、GPO-PAP法、己糖激酶法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 室溫24～25 ℃下不同保存時(shí)間對(duì)標(biāo)本常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的影響 32份標(biāo)本在0、2、4、6和8 h后檢測(cè)，K、NA、CL、ALB、CR、CA、P、ALP、CHO、HDL-C、LDL-C、CK、GLU、CHE的CVmax均小于或等于CV室內(nèi)，表明以上項(xiàng)目在8 h室溫內(nèi)保存結(jié)果穩(wěn)定。TP、MG、UA和HBDH的CVmax雖大于CV室內(nèi)，但其基本在CV指標(biāo)范圍內(nèi)，說明其變異是可接受的。對(duì)于其他CVmax不在控制范圍內(nèi)的項(xiàng)目，通過線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)不同保存時(shí)間的LDH和NEFA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其水平隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而升高。見表1、2。

表1 室溫下在不同保存時(shí)間各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均值

表2 室溫下各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果與保存時(shí)間的線性回歸及檢測(cè)結(jié)果CV分析

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.2 冰箱冷藏不同時(shí)間對(duì)標(biāo)本常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的影響 32份標(biāo)本在2～8 ℃冰箱冷藏0、2、4、6和8 h后檢測(cè)，K、NA、CR、CA、ALP、MG、CHO、HDL-C、LDL-C、CK、GLU和 CHE的CVmax均在室內(nèi)質(zhì)控的不精密度范圍內(nèi)，表明以上項(xiàng)目在8 h冰箱內(nèi)冷藏保存結(jié)果穩(wěn)定。TP、ALB、P、AST、CHO、TG、UA和HBDH的CVmax雖大于CV室內(nèi)，但其基本在CV指標(biāo)范圍內(nèi)，說明其變異是可接受的。對(duì)于CVmax不在控制范圍內(nèi)的項(xiàng)目，通過線性回歸分析，不同保存時(shí)間下UREA和NEFA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中NEFA水平隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而升高，UREA則降低。見表3、4。

表3 在 2～8 ℃冰箱內(nèi)不同保存時(shí)間各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均值

續(xù)表3 在 2～8 ℃冰箱內(nèi)不同保存時(shí)間各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均值

2.3 冰箱冷凍保存對(duì)標(biāo)本常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的影響 3批標(biāo)本在0～7周-80 ℃冰箱冷凍保存過程中，K、NA、CL、TP、ALB、CA、P、MG、CHO、HDL-C和LDL-C的CVmax均小于或等于CV室內(nèi)，表明以上項(xiàng)目在-80 ℃凍存結(jié)果穩(wěn)定。此外，AST、GGT、ALP、TG、UA、HBDH、LDH和CHE的CVmax雖大于CV室內(nèi)，但其基本在CV指標(biāo)范圍內(nèi)，說明其變異是可接受的。對(duì)于其他變異不在控制范圍內(nèi)的項(xiàng)目，通過線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)UREA和ALT僅在第3批標(biāo)本中其不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其r2分別為0.759和0.660。見表5。

對(duì)CVmax超過質(zhì)量指標(biāo)要求的項(xiàng)目UREA、CR、ALT、CK、GLU分別以每批檢測(cè)結(jié)果均值為縱坐標(biāo)，以保存時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖1。5個(gè)項(xiàng)目3批標(biāo)本在同一時(shí)間檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)，考慮為檢測(cè)系統(tǒng)變異。對(duì)UREA、CK和GLU通過計(jì)算3批數(shù)據(jù)箭頭所示時(shí)間點(diǎn)的波峰或波谷點(diǎn)與前一個(gè)點(diǎn)的平均偏移，再對(duì)波峰或波谷點(diǎn)數(shù)值扣除平均偏移所得校正值后計(jì)算連續(xù)7周的CV。因CR和ALT測(cè)定水平偏低，對(duì)3批標(biāo)本中ALT>20 U/L的ALT檢測(cè)結(jié)果和CR>20 μmol/L的CR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行再次CV統(tǒng)計(jì)分析。上述5個(gè)項(xiàng)目校正和重新分析結(jié)果見表6。校正和重新分析后的CVmax基本在CV指標(biāo)范圍內(nèi)。

表4 冰箱冷藏時(shí)各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果與保存時(shí)間的線性回歸及檢測(cè)結(jié)果CV分析

續(xù)表4 冰箱冷藏時(shí)各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果與保存時(shí)間的線性回歸及檢測(cè)結(jié)果CV分析

表5 3批標(biāo)本在冰箱冷凍保存7周的常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的CV及線性回歸分析

表6 UREA、CR、ALT、CK和GLU校正與重新分析結(jié)果(%)

注：A～E分別為-80 ℃保存UREA、CR、ALT、GLU、CK均值變化；1、2、3表示第1批、第2批、第3批；箭頭所示方向?yàn)?批標(biāo)本在同一時(shí)間均值變化。
圖1 -80 ℃保存UREA、CR、ALT、GLU、CK均值變化

3 討 論

生化檢測(cè)是醫(yī)院常規(guī)血液檢測(cè)項(xiàng)目,其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度與標(biāo)本質(zhì)量密切相關(guān)。而標(biāo)本質(zhì)量受患者狀態(tài)、標(biāo)本采集、處理和保存的影響。標(biāo)本處理后最好是及時(shí)檢測(cè)，但在儀器故障、進(jìn)行標(biāo)本比對(duì)或選擇批量檢測(cè)過程中均需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行暫時(shí)保存，選擇適當(dāng)?shù)谋４娣绞绞潜ＷC標(biāo)本質(zhì)量的關(guān)鍵。本研究對(duì)室溫、冷藏和冷凍3種常見的血清標(biāo)本保存方式下常規(guī)生化項(xiàng)目結(jié)果的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，提供了相關(guān)的數(shù)據(jù)支持。

有研究報(bào)道室溫25 ℃和4 ℃下分離后血清標(biāo)本常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果可穩(wěn)定12 h[3-4]。采用分離膠促凝管保存的血清樣本室溫保存6 h時(shí)ALT和K升高,4 ℃下TP和GLU升高[5]。同時(shí)也有研究報(bào)道室溫下標(biāo)本保存超過6 h,電解質(zhì)升高，ALT和AST水平明顯下降[6]。本研究中血清標(biāo)本在室溫24～25 ℃或2～8 ℃下放保存8 h，大部分常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果變異在可接受范圍內(nèi)，特別是K、NA、CR、CA、ALP、CK、GLU、CHE、CHO、HDL-C、LDL-C的CV控制在室內(nèi)不精密度范圍內(nèi)，表現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。但需要注意的是LDH、NEFA和UREA。NEFA無論在室溫保存和冰箱冷藏，均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，同時(shí)室溫保存NEFA水平8 h后升高更加顯著，冰箱冷藏4 h基本穩(wěn)定，保存8 h后NEFA水平可升高，與陳益川等[7]報(bào)道結(jié)果基本一致，而NEFA水平升高是源于脂類間的轉(zhuǎn)化[8]。研究中LDH水平在室溫下出現(xiàn)明顯升高，冷藏時(shí)不明顯，可能與紅細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放有關(guān)。有研究報(bào)道分離膠儲(chǔ)存管可有效分隔血清和紅細(xì)胞，但采用分離膠管保存血清進(jìn)行葡萄糖檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而降低[9]。而王丹鳳等[10]報(bào)道將分離后的血清標(biāo)本置于2～8 ℃保存，72 h內(nèi)LDH檢測(cè)結(jié)果與采集后即刻分離血清檢測(cè)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，也說明分離膠管可能存在干擾。在室溫和冰箱冷藏保存8 h UREA水平呈下降趨勢(shì)，其原因可能與尿素的分解揮發(fā)有關(guān)。

本研究中分離后血清標(biāo)本在-80 ℃保存時(shí)大部分常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果CV都在可接受范圍內(nèi)，與其他研究結(jié)果報(bào)道一致[11-12]。對(duì)于CV超過可接受范圍項(xiàng)目UREA、CR、ALT、CK、GLU進(jìn)一步的分析中發(fā)現(xiàn)，3批UREA、CK和GLU的均值變化曲線一致，說明檢測(cè)系統(tǒng)帶來的變異是造成結(jié)果偏倚的重要原因，通過對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)偏倚校正后，3個(gè)項(xiàng)目的CV基本在可接受范圍內(nèi)。當(dāng)ALT>20 U/L和CR>20 μmol/L時(shí),兩個(gè)項(xiàng)目的CV是可接受的。

在標(biāo)本保存方式對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響研究中，大多數(shù)研究均采用t檢驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果均值的比較[3-6，10,12-15]，但該方法缺乏不同保存方式下檢測(cè)結(jié)果變異可接受性的分析。本研究首次將在不同保存方式下所得檢測(cè)結(jié)果的變異與室內(nèi)不精密度和臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量指標(biāo)結(jié)合起來，記錄每個(gè)獨(dú)立樣本的變異，并以CVmax來表示一批樣本的變異情況，以線性回歸來分析結(jié)果的變化趨勢(shì)，為生化項(xiàng)目結(jié)果變異的評(píng)估提供了新思路。

本研究中在-80 ℃冰箱冷凍保存血清標(biāo)本制備過程中，為避免不同年齡段兒童各項(xiàng)目水平的差異及可能因年齡原因造成的物質(zhì)類型不同的干擾，每一支標(biāo)本均來自同一歲年齡。結(jié)果表明通過該方法制備的混勻血清標(biāo)本在生化項(xiàng)目上具有較好的穩(wěn)定性，該方法為組織實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)提供了標(biāo)本制備思路。

本研究證實(shí)分離膠儲(chǔ)存管離心后除UREA、LDH和NEFA外，其他常規(guī)生化項(xiàng)目在室溫25 ℃和2～8 ℃下保存8 h的檢測(cè)結(jié)果的變異均控制在可接受范圍，LDH和NEFA水平呈升高趨勢(shì)，UREA水平降低。分離后兒童血清-80 ℃保存7周，常規(guī)生化結(jié)果基本保持穩(wěn)定，ALT測(cè)定結(jié)果低于20 U/L，CR低于20 μmol/L時(shí)會(huì)出現(xiàn)超過質(zhì)量指標(biāo)要求的變異。如果標(biāo)本需要長(zhǎng)期保存，血清分離后-80 ℃冰箱冷凍保存是最好的保存方法。在兒童血清標(biāo)本少的情況下，各年齡段兒童混勻血清為開展兒童相關(guān)項(xiàng)目研究提供了標(biāo)本制備方法。