張?bào)谢蓿?童永清， 黃廣智， 畢良武

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西庚源香料有限責(zé)任公司，廣西 東興 538100； 3.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200；4.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè) 研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)為樟科樟屬植物，又名玉桂，原產(chǎn)于斯里蘭卡，中國廣西、廣東、云南、海南、福建等地也有種植，其中廣西、廣東為主產(chǎn)區(qū)[1]。肉桂作為我國傳統(tǒng)的中藥材，具有補(bǔ)火助陽、散寒止痛、引火歸元等傳統(tǒng)功效，現(xiàn)代研究[2-3]表明其還有抗菌、抗炎、抗腫瘤及雙向調(diào)節(jié)體溫等作用。肉桂葉含精油1.0%左右，肉桂葉精油化學(xué)成分復(fù)雜，主要成分為反式肉桂醛、順式肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、鄰甲氧基苯甲醛和乙酸肉桂酯等，其中含量最高的為反式肉桂醛[4-6]。Duan等[7]的研究表明肉桂葉精油具有抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸道沙門菌、枯草芽孢桿菌等有抑制作用。目前，國內(nèi)外有關(guān)肉桂葉精油的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理藥效方面[8-10]，而對肉桂生長條件(如生長環(huán)境、肉桂樹齡)、采收月份及倉儲時(shí)間等因素的研究較少，相關(guān)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)極為缺乏。筆者的前期研究[11]表明肉桂的生長環(huán)境和生長年限對肉桂出油率、揮發(fā)油成分及抑菌活性均有一定影響。因此，本研究以不同生長條件的肉桂葉為研究對象，采用水蒸氣蒸餾法提取精油，對比精油含量差異；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定各精油的化學(xué)組成；采用濾紙片法對其抑菌效果進(jìn)行評價(jià)，以期為闡明肉桂生長條件對肉桂葉精油品質(zhì)的影響提供依據(jù)，也為肉桂的科學(xué)種植及肉桂葉的科學(xué)采收提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

表1 不同生長條件的樣品Table 1 Samples of different growth conditions

1)G:常規(guī)general planting; S:疏植sparse planting; C:密植close planting

1.1 原料、試劑與儀器

肉桂葉(表1)采自廣西東興市廣西庚源香料有限責(zé)任公司林場不同片區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的葉，采集時(shí)間為2018年9月20日。樣品陰干放置60 d，備用。

慶大霉素藥敏紙片，含藥量10 μg/片，杭州微生物試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853，購買于廣東省微生物菌種保藏中心；石油醚、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醇和二甲基亞砜等試劑均為分析純。

SW-CJ-1FD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YX-24LDJ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SPX-B型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SXKW型數(shù)顯控溫電熱套；QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀，日本Shimadzu公司。

1.2 肉桂葉精油的提取

分別稱取不同生長條件的7組肉桂葉各100 g，剪碎，置于揮發(fā)油提取裝置中，加入純水1 L，浸泡1 h，水蒸氣蒸餾提取5 h，靜置分液，無水硫酸鈉干燥，得到相應(yīng)的肉桂葉精油。每組設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值即為該組肉桂葉精油得率。將每組的3份油樣合并，用移液槍分別取合并后的7份肉桂葉精油各100 μL，丙酮定容于2 mL容量瓶，待GC-MS分析。

1.3 肉桂葉精油的成分分析

按照文獻(xiàn)[12]的色譜條件和質(zhì)譜條件對7份樣品進(jìn)行分析，結(jié)果與NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫比對，分析鑒定各類化學(xué)成分，以峰面積歸一化法計(jì)算各成分的GC含量。

1.4 抑菌活性測定

按照文獻(xiàn)[13]中濾紙片法，選擇金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)為供試菌種。分別將7份肉桂葉精油用無水乙醚配制成質(zhì)量濃度500 g/L樣品溶液，用移液槍各滴加10 μL樣品溶液于不同菌種的培養(yǎng)基平板中間貼雙層已滅菌濾紙片(d=6 mm)上，以溶劑乙醚作為空白對照，含藥量為10 μg的慶大霉素作為陽性對照。將各平板置于恒溫箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察各樣品的抑菌效果，采用十字交叉法測量抑菌圏直徑。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

肉桂葉精油的提取和抑菌試驗(yàn)，每組均設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Excel 2010軟件處理和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉桂葉精油得率分析

圖1 不同生長條件的肉桂葉精油總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of cinnamon leaves oil from different growth conditions

7種生長條件(No.1～No.7)下肉桂葉精油得率分別為1.25%、0.64%、1.60%、1.34%、1.20%、0.55% 和0.51%。由數(shù)據(jù)可知，肉桂葉精油得率受肉桂樹齡的影響最為顯著，5年生(No.1)肉桂葉與15年生(No.3～No.5)的精油得率遠(yuǎn)高于10年生(No.2)與20年生(No.7)肉桂葉精油得率。這與朱羽堯等[14]報(bào)道的肉桂葉出油率0.48%有所差異，原因可能與產(chǎn)地、肉桂葉采摘月份及存放時(shí)間等因素有關(guān)。肉桂種植坡向的影響也比較明顯，15年生南坡(No.5)肉桂葉精油得率1.20%明顯高于15年生北坡(No.6) 0.55%，坡向?qū)θ夤鹑~精油得率的影響與莫開林等[15]得到的陽坡油樟在高峰期精油得率要比陰坡的高這一結(jié)論相似。廣西防城港地區(qū)肉桂多種植在南坡，每年秋季肉桂葉通常從9月底開始采收。從15年生(No.3～No.6)肉桂葉精油得率上看，目前防城港地區(qū)肉桂的種植坡向和肉桂枝葉的采收月份是比較科學(xué)的。肉桂種植密度的影響最小，15年生疏植(No.3)肉桂葉精油得率1.60% 略高于15年生密植(No.4)。

2.2 肉桂葉精油成分分析

對不同生長條件的7份肉桂葉精油進(jìn)行GC-MS分析，鑒定出各樣品成分的總流離子圖，見圖1。利用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物GC含量，分析鑒定結(jié)果見表2。從7份肉桂葉精油樣品中共鑒定出28個(gè)組分，其中，5年生(No.1)、10年生(No.2)、15年生疏植(No.3)、15年生密植(No.4)、15年生南坡(No.5)、15年生北坡(No.6)、20年生(No.7)肉桂葉精油分別鑒定出9、11、21、7、7、9和19種組分，總GC含量分別為89.47%、89.37%、96.61%、95.93%、92.48%、95.99%和95.34%。7份油樣中共有組分有4種，分別為苯甲醛、苯丙醛、順式肉桂醛和反式肉桂醛；精油中含量最高的成分均為反式肉桂醛，其中15年生密植(No.4)肉桂葉精油中反式肉桂醛GC含量高達(dá)90.26%，除10年生(No.2)肉桂葉精油中反式肉桂醛GC含量較低(67.73%)外，其余6份樣品均符合國標(biāo)GB 1886.207—2016中國肉桂油中對于反式肉桂醛GC含量(≥74.00%)的規(guī)定。此外，肉桂油中的常見成分鄰甲氧基肉桂醛、乙酸肉桂酯和香豆素的GC含量在不同生長條件的肉桂葉精油中差異顯著，15年生疏植(No.3)肉桂葉精油中鄰甲氧基肉桂醛GC含量最高(13.31%)，10年生(No.2)肉桂葉精油中乙酸肉桂酯GC含量最高(5.74%)，而香豆素只在9月采摘的20年生(No.7)肉桂葉精油中檢出，其GC含量為3.87%。

表2 不同生長條件肉桂葉的精油成分Table 2 Volatile compounds identified in the cinnamon leaves from different growth conditions

2.3 抑菌活性比較

在不同菌種的培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)了大小不一的抑菌環(huán)，抑菌活性測定結(jié)果見表3。

表3 不同生長條件肉桂葉精油的抑菌活性1)Table 3 Antimicrobial activities of cinnamon leaves oil from different growth conditions

1)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) different lower-case letters indicate significant differences(P<0.05)

總的來說，不同生長條件的肉桂葉精油對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，對大腸桿菌的抑制次之，而對綠膿桿菌的抑制最弱，其抑菌圈直徑范圍分別為22.57～39.63 mm、27.58～34.31 mm和16.39～23.89 mm。其中20年生(No.7) 肉桂葉精油對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為39.63 mm；15年生密植(No.4)肉桂葉精油對大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為34.31 mm；5年生(No.1)肉桂葉精油對綠膿桿菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為23.89 mm。此外，7份樣品對這3種菌種的抑制作用強(qiáng)弱排序不完全一致。

3 結(jié) 論

3.1樹齡對精油得率的影響最大，15年生疏植(No.3)精油得率最高(1.60%)，20年生(No.7)最低(0.51%)；其次是坡向的影響，15年生南坡(No.5)精油得率(1.20%)顯著高于15年生北坡(No.6, 0.55%)；種植密度影響最小，15年生疏植(No.3, 1.60%)略高于15年生密植(No.4, 1.34%)。

3.2不同生長條件肉桂油精油共鑒定出28種化學(xué)成分，其中15年生疏植(No.3)的精油成分最多(21種)，15年生密植(No.4)和15年生南坡(No.5)最少，均為7種。反式肉桂醛均為其中GC含量最高的成分，在No.4精油中GC含量最高(90.26%)，在10年生(No.2)中GC含量最低(67.73%)。

3.3500 g/L肉桂葉精油樣品均對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制效果較好，對綠膿桿菌的抑制較弱，抑菌圈直徑分別為22.57～39.63 mm， 27.58～34.31 mm和16.39～23.89 mm。20年生(No.7)肉桂葉精油對金黃色葡萄球菌抑制作用顯著，抑菌圈直徑39.63 mm。