李井春，王碩，李雁冰，王國鑫，魏國生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

目前，豬人工授精技術(shù)隨著近些年國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展愈加成熟，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展也愈發(fā)加快了腳步，從而人工授精技術(shù)也相應(yīng)成為家畜生產(chǎn)中主要的繁殖手段，豬人工授精最大的優(yōu)點就是以少量的優(yōu)良公豬的精液能為更多的母豬配種，加速遺傳改良[1]，豬的人工授精的成敗在很大程度上取決于精液的質(zhì)量[2]，隨著人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)的廣泛應(yīng)用，精液保鮮技術(shù)逐步走入大眾的視野，獲得了日漸增多的關(guān)注[3]。精液保存技術(shù)的穩(wěn)固可以使優(yōu)質(zhì)基因的傳播得以促進，可以加寬精液地域上的使用，提高精液的利用率以及提升豬品種的改良成效，穩(wěn)定的精液保存技術(shù)也可以控制某些病原體的傳播[4]。精液常溫保存的機理是通過減緩或抑制精子新陳代謝的速度，同時避免精子在體外受損傷，從而延長豬精子在體外存活的時間。國內(nèi)豬精液保存的研究主要分為兩種方式，一種就是豬精液的冷凍保存，另一種就是豬精液的常溫保存。因為豬精子自身特有的生理性質(zhì)，經(jīng)過冷凍的精子在解凍后投入使用后存在存活率低、受胎率不理想的問題，而常溫保存操作簡單方便，便于短期保存[5]，所以常溫下豬精液保存方法的研究也就成為今后豬精液保存的方向。精液常溫保存受多種因數(shù)影響，如稀釋液的pH值、滲透壓、抗氧化性等，這些影響因數(shù)直接或間接的影響精子質(zhì)量以及受胎率，研究表明在一次輸精中有45%左右的精子損失，通過改進稀釋液配方，從而提高精液質(zhì)量進而提高受胎率[6-7]。

大多數(shù)細胞培養(yǎng)實驗中均需在培養(yǎng)液中添加一定量的血清，常用的血清為胎牛血清或小牛血清，因為血清含有激素、生長因子、結(jié)合蛋白、微量元素等物質(zhì)，這些物質(zhì)在細胞的生長和調(diào)控細胞生存環(huán)境的穩(wěn)定等方面起到重要作用。胎牛血清（FBS）是一種外觀淺黃色澄清、無溶血、無異物稍黏稠液體，F(xiàn)BS取自剖腹產(chǎn)的胎牛。FBS功能包括：FBS含有的蛋白酶抑制劑可使細胞中胰蛋白酶失活，保護精子細胞不受傷害；在溶液中，可起到酸堿緩沖的作用；FBS含有的結(jié)合蛋白能夠識別維生素類物質(zhì)、脂類物質(zhì)、金屬離子和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)節(jié)所結(jié)合物質(zhì)的活力[8]。試驗選擇Modena稀釋液作為基礎(chǔ)稀釋液，該稀釋液在壓強、滲透液、稀釋液的篩選等實驗中取得良好的效果[9]。試驗通過在Modena稀釋液中添加不同體積分數(shù)的滅活和非滅活的FBS，在17℃負壓環(huán)境下以精子活率、直線速度、側(cè)擺幅度等為檢測參數(shù)。分析胎牛血清對豬精液保存效果，試驗結(jié)果對豬人工授精生產(chǎn)實踐起到一定指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

滅活胎牛血清、非滅活胎牛血清；Modena稀釋液配方為每1 L溶液中分別準確稱量藥品含量為：葡萄糖 27.50 g；TRIS 5.65 g；EDTA-2Na 2.6 g；檸檬酸鈉6.9 g；NaHCO31 g；檸檬酸 2.9 g；BSA 4 g（現(xiàn)用現(xiàn)配）；青霉素 0.074 g；鏈霉素 0.05 g。無特殊說明下，藥品成分均購自西格瑪公司。

1.2 精液來源

試驗所用樣品豬精液來自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場，對所選擇的公豬要求在3 d內(nèi)未進行過采精活動，采集3頭健康長白種公豬精液，年齡為2～3歲。精液品質(zhì)要求為無異味、色澤為乳白色、密度在2億以上、精子活力在0.7以上的精液，將3頭合格精液分別取等量體積混合在一起保存。豬采集后盡快從豬場在1～2 h內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇遥\輸過程的保溫工具為泡沫保溫箱，泡沫保溫箱需封閉完好，避免由于溫度下降過快而引起精子冷應(yīng)激。同時在運輸過程行車穩(wěn)定，以減少劇烈晃動對豬精子的機械損傷。

1.3 實驗方法

1.3.1 豬精液的稀釋

將豬精液運送到實驗室后，需將精液放入經(jīng)過紫外線滅菌后的無菌操作臺內(nèi)，精液需在室溫下緩慢穩(wěn)定的平衡降溫30 min。平衡降溫后檢測豬精子活力，精子活力不低于0.7[10]，則符合實驗要求。原精液稀釋處理方法為，將適量原精液分別裝入離心管中，離心機轉(zhuǎn)數(shù)調(diào)節(jié)為1 800 r·min-1，離心時間調(diào)節(jié)為5 min。通過精板計數(shù)法計算離心后沉降的精液精子密度，將各試驗組精子密度均調(diào)節(jié)為1×108個·mL-1，整個稀釋過程要在短時間內(nèi)完成，減少精子沉積造成損傷的發(fā)生，稀釋處理后各試驗組需放置在室溫下待用。

1.3.2 精液保存處理

將各試驗組的試管口用鋁紙蓋住，但要與外界氣流相通，將試管緩慢放于負壓保存瓶中靜立，通過導(dǎo)管將負壓保存瓶與真空泵機鏈接，將負壓保存瓶內(nèi)負壓調(diào)整為0.4倍大氣壓強。然后將負壓瓶置于17℃恒溫箱中保存。每間隔12 h對精液進行一次混勻，且搖勻過程要緩慢進行。

1.3.3 精子質(zhì)量參數(shù)的檢測

試驗在保存的各時間點（1，2，3，4，5 d）各組取出適量樣品，置于37℃加熱板上回溫2～3 min，通過精子分析儀檢測各試驗組豬精子活率、直線速度、路徑速度、側(cè)擺幅度等質(zhì)量參數(shù)，并記錄試驗數(shù)據(jù)。

1.4 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)計5組，在Modena基礎(chǔ)稀釋液中分別添加滅活和非滅活的FBS，調(diào)節(jié)體積分數(shù)分別為0、5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%的FBS，并對每組進行負壓處理，在17℃恒溫箱保存。試驗設(shè)4次重復(fù)試驗。通過邁朗全自動精子分析儀檢測不同的保存時間下精子活率、路徑速度，直線速度、側(cè)擺幅度等質(zhì)量參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

將各時間點的各試驗組精子的各質(zhì)量參數(shù)數(shù)據(jù)通過Excel進行初步匯總，再利用StatView 5.0軟件對試驗測定的各項質(zhì)量參數(shù)進行方差分析和多重比較，實驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差來表示。同行數(shù)據(jù)肩標字母不同，表示差異顯著P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 胎牛血清對精子活率的影響

由表1可知，各組隨著保存時間的延長豬精子活率不同程度的逐漸下降，在2 d時滅活10%FBS組豬精子活率與對照組差異不顯著，與5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組差異顯著（P<0.05）；從4 d起對照組與5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組豬精子活率相比有顯著差異（P<0.05），在4 d時5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間豬精子活率差異不顯著（P>0.05）；在5 d時10%滅活組豬精子活率顯著0、5%滅活、非滅活5%、非滅活 10%FBS組（P<0.05），且5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間差異不顯著（P>0.05）。

表1 胎牛血清對精子活率的影響Table 1 The effect of FBS on sperm motility rate

2.2 胎牛血清對精子路徑速度的影響

由表2可知，各組隨著保存時間的延長豬精子路徑速度不同程度的逐漸下降，在1 d時各組精子路徑速度差異不顯著（P>0.05）；在2 d時對照組豬精子路徑速度顯著低于5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活 10%FBS組（P>0.05）；3 d后對照組與非滅活5%FBS組豬精子路徑速度隨著時間的增加變化明顯，在4 d時10%滅活FBS組精子路徑速度顯著高于0、5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組（P<0.05）；在5 d時0滅活組精子路徑速度顯著高于0、5%滅活、非滅活 5%、非滅活 10%FBS組（P>0.05），且5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組精子路徑速度顯著高于對照組（P<0.05）。

表2 胎牛血清對精子路徑速度的影響Table 2 The effect of FBS on sperm path velocity

2.3 胎牛血清對精子直線速度的影響

由表3可知，各組隨著保存時間的延長豬精子直線速度不同程度的逐漸下降，從1 d起5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組豬精子直線速度顯著高于對照組（P<0.05）。在5 d時10%滅活FBS組與非滅活5%FBS組差異不顯著（P>0.05），10%滅活FBS組與非滅活5%FBS組豬精子直線速度顯著高于滅活5%、非滅活10%FBS組（P<0.05），且5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組精子直線速度顯著高于對照組（P<0.05）。

表3 胎牛血清對精子直線速度的影響Table 3 The effect of FBS on sperm linear velocity

2.4 胎牛血清對精子側(cè)擺幅度的影響

由表4可知，各組隨著保存時間的延長豬精子側(cè)擺幅度變化緩慢，在1 d時0、5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間豬精子側(cè)擺幅度差異不顯著（P＞0.05）；在 2～3 d時 10%滅活 FBS組豬精子側(cè)擺幅度顯著高于0、5%滅活、非滅活5%、非滅活 10%FBS組（P＜0.05）；在4 d時5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間豬精子側(cè)擺幅度差異不顯著（P＞0.05），且 5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組豬精子側(cè)擺幅度顯著高于對照組（P＜0.05）；在5 d時10%滅活FBS組豬精子側(cè)擺幅度顯著高于0、5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組（P＜0.05），且 5%滅活、10%滅活、非滅活5%FBS組之間豬精子側(cè)擺幅度差異不顯著（P＞0.05），5%滅活、10%滅活、非滅活5%FBS組豬精子側(cè)擺幅顯著高于對照組（P＜0.05）。

表4 胎牛血清對精子側(cè)擺幅度的影響Table 4 The effect of FBS on sperm side swing amplitude

3 討論

試驗中，選用的Modena基礎(chǔ)稀釋液對精子保存效果良好，在鮮精中加入一定比例的稀釋液能夠為精子創(chuàng)建出與公豬睪丸內(nèi)相似的滲透壓、pH值、低代謝強度等的存活環(huán)境，可排除對精子長期保存利的因素，同時在17℃負壓環(huán)境下可有效降低精子的代謝強度，使精子處于半休眠狀態(tài)，從而延長保存時間。豬的稀釋液中所含的多種成分對精液長期保存非常有利，例如在Modena稀釋液中的緩沖物質(zhì)可維持精液pH的穩(wěn)定，碳酸氫鈉、檸檬酸鈉等添加劑可中和稀釋液中細菌的代謝產(chǎn)物，從而維持稀釋液pH的穩(wěn)定[10]。而試驗中在稀釋液中分別添加5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%的FBS，目的在于利用FBS具有抑制胰蛋白酶活性、可起到酸堿緩沖的作用、能夠結(jié)合識別稀釋液中多種成分等功能，從而弱化豬稀釋液中的有害物質(zhì)對精子的損傷，減緩由于豬精子代謝、細菌滋生、營養(yǎng)物質(zhì)衰變等引起的pH下降速度過快的過程，提高精液的保存時間以及精液質(zhì)量。

試驗結(jié)果表明：在基礎(chǔ)稀釋液中加入10%滅活FBS試驗組，精子活率、直線速度、路徑速度、側(cè)擺幅度等指標均為最好，維持的時間長達5 d，其他3組試驗組綜合評價來看各組間差異不顯著，并都優(yōu)于對照組。精子活率是一項檢驗精液質(zhì)量的常規(guī)指標，精子的活率和運動性與精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性緊密相關(guān)，并且可以對精子潛在的授精能力作出預(yù)測[11-12]。精子活力對配種效率、產(chǎn)仔數(shù)、生產(chǎn)性能等都有很大影響，精子活力對雄性生育和受精是很重要的，是保證精子在受精過程中與卵子相遇的重要條件[13-14]，而直線速度和路徑速度是反應(yīng)精子活力的重要指標[15]，同時側(cè)擺幅度的變化可以反應(yīng)出精子超激活程度[16]，精子尾部側(cè)擺幅度越強，其活力越高，受精能力越好[17]。試驗中，選擇的精子質(zhì)量參數(shù)都直接或間接的反應(yīng)出在豬稀釋液中添加10%滅活FBS對豬精液保存的優(yōu)良效果。

FBS的滅活處理方法主要是56℃加熱30 min，滅活物質(zhì)主要為補體、蛋白質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)等熱敏感物質(zhì)。研究表明[18]，滅活過程減弱了FBS對細胞的促黏附作用，試驗中精液保存效果10%滅活FBS組優(yōu)于10%非滅活FBS組，推測是FBS提高了精子細胞的黏附性，從而降低了精子的運動性能以及細胞膜的物質(zhì)運輸代謝過程。目前在諸多實驗中對FBS滅活目的在于剔除補體對實驗的影響，研究表明補體具有提高細胞通透性作用，在非滅活試驗組中可能補體提高了精子細胞膜通透性，導(dǎo)致一些有害離子及有毒物質(zhì)進入細胞內(nèi)，同時通透性的提高降低了精子的抗冷應(yīng)激能力，破壞精子細胞內(nèi)環(huán)境，使精子各項質(zhì)量參數(shù)下降加快。并且未滅活的FBS某些成分能夠結(jié)合、滅活、拮抗或協(xié)同激素和藥物的作用[2]，從而影響精液的保存效果。豬精子隨著保存時間的延長，由于精子代謝和細菌滋生稀釋液中的產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS對豬精子膜的損傷是破壞性的，試驗中從第3 d開始對照組豬精子質(zhì)量大幅度下降，而添加FBS的各試驗組下降幅度較小，可能是FBS中某種物質(zhì)起到抗氧化的作用。研究表明，在FBS中的微量元素硒具有抑制過氧化物酶對細胞的毒性作用，從而緩解ROS對精子細胞膜的損傷。根據(jù)試驗結(jié)果可知對FBS滅活處理后加入基礎(chǔ)液中是有必要的。

試驗精液保存在2 d時，各組不同程度出現(xiàn)細菌滋生情況，茆達干等[19]研究表明，精液被細菌污染，對精液影響極大，可在短時間內(nèi)使精子活力、pH值等大幅度下降。精液中大多數(shù)細菌為革蘭氏陰性菌，其中產(chǎn)生的脂多糖毒性較大[20]。研究表明[8]，F(xiàn)BS能結(jié)合脂多糖而起解毒作用，并且具有緩沖酸堿度的作用，從而緩解細菌滋生導(dǎo)致的pH值下降問題，同時FBS中所含的蛋白酶抑制因子可以保護精子細胞免受稀釋液中蛋白酶的損傷。除此之外，F(xiàn)BS成分中還含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對精液的保存是非常有利的[21]，例如FBS成分中的胰島素能與細胞膜上受體結(jié)合形成復(fù)合物，具有調(diào)節(jié)和控制細胞內(nèi)多種代謝途徑的作用，加強糖原、蛋白質(zhì)、三酸甘油脂等的合成，同時認為胰島素并非本身起到作用，而可能是結(jié)合某些物質(zhì)或者某些微量元素而發(fā)揮作用。又如FBS成分中的結(jié)合蛋白可結(jié)合培養(yǎng)液中的有毒金屬離子，從而減少有害離子進入精子細胞內(nèi)的數(shù)量，減弱對精子細胞內(nèi)環(huán)境的破壞，同時能夠與脂類、激素等因子結(jié)合具有調(diào)節(jié)細胞代謝的作用，但FBS在試驗中起到的具體作用有哪些方面，需要進行更深入的探究。從試驗結(jié)果可知，添加FBS的各試驗組各項參數(shù)都顯著高于對照組，說明研究中將FBS的多種功能用于解決豬精液長期保存中所面臨的諸多問題是可行的。同時實驗采用負壓處理，模擬公豬睪丸負壓低氧環(huán)境，可有效降低精液含氧量，減緩精子代謝過程，再結(jié)合FBS的多種功能，從而完善精液配方，提高精液的保存時間及其精液質(zhì)量。

4 結(jié)論

試驗得出在精液基礎(chǔ)液中添加一定量的FBS在17℃負壓環(huán)境下可顯著提高豬精子活率、路徑速度、直線速度、側(cè)擺幅度。其中10%滅活FBS組各項參數(shù)顯著優(yōu)于其他組，添加10%滅活FBS是最有利于豬精子在17℃負壓環(huán)境下保存的，研究結(jié)果為豬人工授精生產(chǎn)實踐中精液保存技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。