許麗婷 徐彬人 盛 蒙 吳 瓊 王文佳 田維毅 俞 琦

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味藥物組成，是清熱解毒最具代表的方藥之一，具有瀉火解毒功效，主治熱毒充斥三焦之證。其臨床應(yīng)用非常廣泛，對(duì)Ⅱ型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、老年性癡呆等病癥有明顯療效[1-3]。現(xiàn)代研究證實(shí)，黃連解毒湯可通過(guò)抗炎、降血脂、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[4]。但其對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響及作用機(jī)制尚不明確。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)是調(diào)控細(xì)胞膽固醇流出的有效途徑，其表達(dá)不足將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)沉積大量的膽固醇，加重動(dòng)脈粥樣硬化病變。本研究擬采用黃連解毒湯含藥血清干預(yù)泡沫細(xì)胞，觀察黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白及膽固醇含量的影響，探討黃連解毒湯是否通過(guò)調(diào)節(jié)ABCA1蛋白表達(dá)及泡沫細(xì)胞膽固醇流出而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，購(gòu)自上海中僑新舟。

1.2 藥物與試劑 黃連、黃芩、黃柏、梔子購(gòu)自同仁堂貴陽(yáng)藥店，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為正品。胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，DMEM和青鏈霉素混合液(美國(guó)Gibco公司)，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，廣州奕源生物)，總膽固醇及游離膽固醇檢測(cè)試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)。ABCA1和β-actin引物(上海生工生物工程)。

1.3 動(dòng)物 健康SD大鼠24只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷(xiāo)售有限公司，許可證號(hào): SCXK-( 軍) 2012-0011。

1.4 主要儀器 SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；PCR 儀(美國(guó)ABI Applied Biosystems)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 制備黃連解毒湯含藥血清 上述藥材按傳統(tǒng)方法進(jìn)行水煎煮，煎煮兩次，合并兩次濾液，即得黃連解毒湯水煎劑。調(diào)整濃度為相當(dāng)于生藥2 g/mL，置4℃冰箱備用。SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，黃連解毒湯大、中、小劑量組，每組6只。大、中、小劑量組分別以6、3、1.5 g生藥/kg灌胃給藥，體積為1 mL/100 g(大鼠體重)；正常組給予等體積蒸餾水。2 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后股動(dòng)脈采血，常規(guī)制備血清，56 ℃ 30 min 滅活補(bǔ)體，0.22 μm過(guò)濾除菌，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10 %胎牛血清和1 %雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以2×105個(gè)/m L的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，用ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。細(xì)胞分為：空白組、模型組(培養(yǎng)液+80 μg/mL ox-LDL)和黃連解毒湯大、中、小劑量組(20%黃連解毒湯含藥血清大、中、小劑量+80 μg/mL ox-LDL)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。

2.3 泡沫細(xì)胞油紅O染色 用PBS液洗滌各組細(xì)胞，用50%異丙醇進(jìn)行固定，油紅O工作液染色15 min后沖洗5 min；蘇木精染色10 min，沖洗，氨水返藍(lán)后顯微鏡下觀察，紅色顆粒為蓄積的脂質(zhì)。

2.4 泡沫細(xì)胞中膽固醇含量的測(cè)定 裂解各組細(xì)胞，收集裂解細(xì)胞上清液，測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)和游離膽固醇(FC)的含量。具體按膽固醇檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá) 收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA 的濃度以及純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，PCR條件: 95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。ABCA1引物序列為：上游：5′-TAC CAG CAT TAA GGA CAT GCA C-3′；下游：5′-TTT GAT CCG TTA CAC AGA CTG G-3′。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析RNA，分析各組目的基因的灰度值，以目的基因與β-actin基因的比值代表ABCA1 mRNA的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞的影響 油紅O染色顯示，空白組細(xì)胞無(wú)著色，模型對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈空泡樣，泡沫細(xì)胞中有大量脂質(zhì)蓄積。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著減少，大劑量組細(xì)胞內(nèi)脂滴減少最明顯(見(jiàn)圖1)。

圖1 油紅O染色檢測(cè)黃連解毒湯含藥血清作用于泡沫細(xì)胞

3.2 黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞中膽固醇含量的影響 與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組細(xì)胞TC含量明顯下降(P<0.05或P<0.01)；黃連解毒湯含藥血清大劑量組細(xì)胞FC含量顯著降低(P<0.01)，小和中大劑量組無(wú)明顯差異(見(jiàn)表1)。

組別nTC/μmol/LFC/μmol/L空白組652.26±4.1524.38±3.65模型組6136.83±10.341)59.07±9.301)含藥血清小劑量組6124.51±16.602)56.26±8.24含藥血清中劑量組696.89±15.883)62.42±11.95含藥血清大劑量組682.18±12.673)48.33±6.122)

注：與空白組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01。(圖2同)

圖2 黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)的影響

3.3 黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)水平的影響 如圖2所示，與模型組比較，在黃連解毒湯含藥血清的干預(yù)下，隨著劑量的增加，細(xì)胞的ABCA1 基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)。

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是引發(fā)心血管疾病的主要原因，可導(dǎo)致患病人群高死亡率。動(dòng)脈粥樣硬化是一種由斑塊堆積引起的動(dòng)脈內(nèi)部狹窄的疾病，其斑塊的主要成分是脂肪、膽固醇、鈣和血液中其他物質(zhì)。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段，隨著胞內(nèi)的ox-LDL堆積、脂質(zhì)負(fù)載，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)為泡沫細(xì)胞。病理過(guò)程中泡沫細(xì)胞凋亡，將膽固醇釋放到血管中，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變[11]。ABCA1是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，激活的ABCA1可促進(jìn)游離膽固醇和磷脂外流形成HDL顆粒，從而影響膽固醇從巨噬細(xì)胞的流出，因此在AS的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[12]。中醫(yī)認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化主要的三大病理因素是濕熱、毒邪和痰淤。黃連解毒湯具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主要用于治療三焦火毒熱盛的癥狀，可用于抵抗動(dòng)脈粥樣硬化的病變進(jìn)程[13]。本研究通過(guò)觀察黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞的作用效果，探討黃連解毒湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清組泡沫細(xì)胞的油紅O染色中脂滴顯著減少，且大劑量組脂滴減少最明顯，說(shuō)明黃連解毒湯減少泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴含量，且有劑量依賴(lài)性。與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯升高。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組細(xì)胞TC含量明顯下降；說(shuō)明黃連解毒湯可以下調(diào)泡沫細(xì)胞脂滴含量，并有劑量依賴(lài)性。黃連解毒湯含藥血清大劑量組細(xì)胞FC含量顯著降低，小和中大劑量組無(wú)明顯差異。說(shuō)明大劑量的黃連解毒湯可促進(jìn)FC外排。與模型組比較，在黃連解毒湯含藥血清的干預(yù)下，隨著劑量的增加，泡沫細(xì)胞的ABCA1 基因表達(dá)明顯升高，說(shuō)明黃連解毒湯可促進(jìn)ABCA1基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯上調(diào)泡沫細(xì)胞ABCA1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出，可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。ABCA1可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一，這對(duì)臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化病變具有指導(dǎo)意義。