鄧咪咪，劉寶玲，王志龍，薛金愛，張紅梅，李潤植

·農業(yè)生物技術·

大豆硬脂酰-ACP Δ9脫氫酶() 基因家族的鑒定及功能分析

鄧咪咪1,2，劉寶玲2，王志龍2，薛金愛2，張紅梅1，李潤植2

1 山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801 2 山西農業(yè)大學 分子農業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801

硬脂酰-ACP Δ9脫氫酶(Stearoyl-acyl carrier protein Δ9desaturase，SAD) 在質體中催化單不飽和油酸或棕櫚油酸的合成，是控制植物細胞飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例的關鍵酶。為解析大豆油酸合成積累調控機制，文中對大豆GmSAD家族成員進行全基因組鑒定和保守功能域及理化性質等分析。應用qRT-PCR檢測各成員的時空表達譜，構建表達載體并通過農桿菌介導煙草瞬時表達和油酸缺陷型酵母突變株BY4389遺傳轉化測試GmSAD酶活性和生物學功能。結果表明，大豆基因組含有5個GmSADs家族成員，其編碼酶蛋白均具有二鐵中心和SAD酶特有的2個保守組氨酸富集基序(EENRHG和DEKRHE)，預測其活性酶蛋白為同源二聚體。系統(tǒng)進化分析顯示5個GmSAD分成2個亞組，分別與擬南芥AtSSI2和AtSAD6親緣關系較近。各成員在大豆根、莖、葉、花和不同發(fā)育時期種子等組織中表達譜差異明顯，其中在發(fā)育種子中、晚期高量表達，與油脂富集時期相吻合。煙草葉片瞬時表達可使葉片組織中油酸和總油脂含量分別提高5.56%和2.73%，而硬脂酸含量相應降低2.46%。缺陷型酵母遺傳轉化測試顯示，過表達能恢復缺陷酵母合成單不飽和油酸的能力和促進油脂積累?？傊?，大豆GmSAD5對硬脂酸底物選擇性較強，能高效催化單不飽和油酸的生物合成，為大豆種子油酸和總油脂積累機制的研究奠定了基礎，也可作為油脂品質遺傳改良的優(yōu)異靶標。

大豆，硬脂酰-ACP Δ9脫氫酶(SAD)，功能分析，油酸，油脂品質

大豆L. Merr是我國及世界重要的糧油作物之一，其高蛋白和高油脂等為人體提供了豐富的氨基酸和脂肪酸營養(yǎng)，是重要的優(yōu)質食品資源，亦可用作畜禽及水產飼料和其他工業(yè)原料。大豆油是全球食用植物油的主要來源之一，占總食用植物油的28%，而且市場需求量逐年增長[1]。大豆油主要由5種脂肪酸組成：棕櫚酸 (C16︰0，約11.38%)、硬脂酸(C18︰0，約4.29%)、油酸(C18︰1Δ9，約15.66%)、亞油酸(C18︰2Δ9,12，約47.33%) 和亞麻酸(C18︰3Δ9,12,15，約15.40%)[2-3]。盡管亞油酸能降低血液膽固醇，預防動脈粥樣硬化，但大豆種子油高達 60%–70%的多不飽和脂肪酸(亞油酸和亞麻酸) 使其容易氧化酸敗，不宜長期貯存，也易引起基于大豆油的食品變質。常規(guī)食用油精煉過程中，需要經過高溫脫臭和添加抗氧化劑來提高大豆油抗氧化性，而這又會產生大量對人體健康有害的反式脂肪酸和其他有害物質。單不飽和油酸兼具飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的優(yōu)良特性，特別是抗氧化性顯著高于亞油酸等多不飽和脂肪酸[4]。食用油酸能降低人體血液中的不良低密度脂蛋白膽固醇含量，避免高血脂癥的發(fā)生，保護心血管健康。因此，諸多研究致力于提高大豆油的油酸比例以增加大豆油氧化穩(wěn)定性和提高大豆油營養(yǎng)價值[5-7]。通過甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS) 誘變，已篩選獲得油酸含量顯著增高的大豆優(yōu)良突變體。應用RNAi沉默大豆(Δ12fatty acid desaturase 2，催化油酸18︰1Δ9生成亞油酸18︰2Δ9,12) 獲得油酸含量達80%，亞油酸含量減低至1%的轉基因大豆[8]。我們實驗室通過對轉錄因子鋅指蛋白進行分析設計，使它能特異地結合大豆酶基因靶序列，關閉該基因表達，獲得了大豆種子高油酸(>80%) 積累的轉基因植株[9-10]。最近，應用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得純合突變體，大豆種子油酸含量>80%、亞油酸減至1.3%–1.7%[11]。這些研究大多是通過阻斷油酸生成亞油酸的酶促反應來提高油酸積累，然而，催化硬脂酸生成油酸的酶分子是硬脂酰-Δ9脫氫酶(Stearoyl-Δ9desaturase，SAD)。鮮有關于大豆SAD家族成員和功能以及遺傳修飾提高油酸富集的詳盡報道。

高等植物細胞含有兩類硬脂酰-Δ9脫氫酶，其一為質體型SAD，在質體內催化硬脂酰-ACP (18︰0-ACP) 生成油酰-ACP (18︰1Δ9-ACP)，在硬脂酰鏈Δ9位置引入第一個碳碳雙鍵[12-14]，該酶促反應需要NADPH、NADPH-鐵氧還蛋白還原酶、鐵氧還蛋白等提供能量[15-16]。其二為細胞型SAD，在細胞內質網上催化硬脂酰-CoA (18︰0-CoA) 生成油酰-CoA (18︰1Δ9-CoA)。一些研究顯示，植物細胞絕大多數油酸(18︰1Δ9) 是在質體內合成，僅有少部分油酸在內質網上合成[17]。質體型SAD是控制植物細胞飽和脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸途徑的重要限速酶，其活性強弱決定著飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例大小[18-19]。近年來，人們已經從擬南芥(L.)Heynh.[14]、棉花spp.[20]、馬鈴薯L.[15]、花生Linn.[21]、甘藍型油菜L.[22]、可可L.[23]等許多植物中分離得到了基因，并驗證了SAD的硬脂酰-ACP脫氫酶活性。例如，干擾表達棉花基因可使油酸含量從13%顯著降低到4%，同時硬脂酸含量從2%–3%增加到約40%[24]。同樣，在6個大豆突變體中，的突變導致大豆種子硬脂酸含量升高，比野生型高1.5–3倍[25]。在擬南芥突變體中過表達基因能夠使突變體恢復催化硬脂酸生成油酸(18︰1Δ9)[14]。過量表達黃羽扇豆L.基因可顯著提高煙草葉片中的油酸含量[26]。在煙草中過表達馬鈴薯基因，葉片和種子的脂肪酸組分發(fā)生了變化，不飽和脂肪酸含量增加[27]。已有研究顯示，植物基因家族不同成員的表達模式具有時空特異性。例如，棉花和在發(fā)育種子中具有較高的表達量，在其他組織中表達較低[20]。可可在各組織中均有表達，和在花中表達較高[23]。鳳丹牡丹基因在根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊、種子中均有表達，且在花瓣中表達最高，在根中表達最低[28]。進一步深入研究這些差異表達SAD家族成員的具體生物學功能和催化底物選擇性等特性，有助于全面解析植物油脂生物合成代謝的調控機制及遺傳改良。

為解析大豆SAD的硬脂酰-ACP脫氫酶(GmSAD) 家族各成員的功能和建立基于遺傳修飾改良大豆優(yōu)質品質的技術策略，本文應用生物信息學工具全基因組鑒定大豆質體型SAD家族成員、基因結構和酶蛋白理化性質等特征。采用實時熒光定量PCR技術分析基因家族各成員的時空表達模式。通過農桿菌介導煙草葉片瞬時表達和在不飽和脂肪酸缺陷 型酵母BY4389超表達目標基因鑒定大豆GmSAD的生物學功能。共檢測到5個其中在大豆種子油脂積累過程中高表達的GmSAD5能高效催化油酸合成，是遺傳工程培育富集油酸或硬脂酸以及提高油脂積累的一個優(yōu)異分子靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的大豆品種，種植于山西農業(yè)大學試驗田。試驗取材為：兩周齡的幼苗根、莖、幼葉、盛花期的花以及開花后(Days Post-Anthesis，DPA) 25 d (種子Ⅰ)、35 d (種子Ⅱ)、45 d (種子Ⅲ) 的大豆種子。所有樣品經液氮速凍后儲存于?80 ℃用于下一步試驗。

本試驗所用的本氏煙草L.種植于營養(yǎng)土中，設置光照培養(yǎng)箱的生長條件為：溫度26 ℃、相對濕度60%、光照︰黑暗=16 h︰8 h[29]。本研究中使用的釀酒酵母H.突變菌株為BY4389缺陷型酵母()，購自日本Osaka University，該BY4389酵母菌株含有突變，無法合成不飽和脂肪酸[30]。

1.2 方法

1.2.1 大豆RNA提取、cDNA鏈的合成及基因克隆

根據北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司的Trizol法提取上述組織的總RNA。利用ABM公司(愛必夢生物科技有限公司) 的5× All-In-One RT MasterMix反轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用基因特異引物及2×GPV8 HF Polymerase Master (通用生物有限公司)高保真酶擴增目的基因的ORF，目的片段經凝膠回收和純化后連入pMD18-T載體并轉入大腸桿菌中，選取陽性菌，并在通用生物公司(安徽) 測序驗證。

1.2.2 大豆基因家族的鑒定及結構分析

選用模式生物擬南芥SAD (AtSADs) 基因家族的蛋白序列作為檢索序列blastp大豆基因組數據庫soybase (https://soybase.org/)，獲得大豆全基因組的基因組序列、CDS序列、氨基酸序列及染色體的位置信息。將檢索到的GmSADs氨基酸序列提交到SMART (http://smart.embl- heidelberg.de/)和CDD數據庫進行驗證，分析鑒定GmSADs蛋白序列的保守結構域(FA_desaturase_2)。

利用網站GSDS2.0(http://gsds. cbi.pku.edu.cn/)對家族進行基因結構分析。

1.2.3 大豆GmSAD家族蛋白的理化性質及結構分析

用ExPASy數據庫(https:// www.expasy.org/)中的ProtParam預測大豆GmSAD家族蛋白的分子量、等電點等理化性質[31]。通過在線工具TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)預測大豆GmSADs家族成員的跨膜結構區(qū)域；然后通過ChloroP 1.1 Server[32]和TargetP 1.1 Server[33]預測GmSAD編碼蛋白的亞細胞定位。

利用SOPMA網站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma. htmL) 預測GmSADs家族成員的二級結構。用在線網站SWISS-MODEL對GmSADs家族成員進行三級結構預測分析并建模。

1.2.4 大豆GmSADs蛋白保守域鑒定及系統(tǒng)進化分析

從NCBI中調取蓖麻(L.) RcSAD1、擬南芥AtSSI2的SAD蛋白序列，用軟件GeneDoc對大豆、蓖麻和擬南芥的SAD蛋白序列進行多序列比對。各物種SAD序列信息見表1。運用MEGA7.0軟件對擬南芥AtSADs、蓖麻RcSAD1、甘藍型油菜BnSAD、馬鈴薯StSAD、可可TcSAD1和大豆GmSADs的氨基酸序列進行比對，并采用鄰接法(NJ)構建無根系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢驗值設置為1 000個循環(huán)[34]。

表1 各物種SAD信息

1.2.5 大豆家族基因的表達分析

以上述大豆各組織的cDNA為模板，利用各基因的特異性引物進行qRT-PCR分析。選用大豆作為內參基因，并設置6個生物學重復。用NCBI中的Primer-BLAST對基因編碼序列設計特異性引物(表2)。依照TB Green? Premix Ex?Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa公司) 說明提供的方法，進行qRT-PCR分析。反應體系為：cDNA模板1 μL，TB Green Premix ExⅡ5 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.2 μL，ddH2O 3 μL。反應程序為：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，退火 1 min；40個循環(huán)。反應在Bio-Rad CFX96TM熒光定量PCR儀上進行。用公式2-ΔΔCq計算各基因表達量，利用IBM SPSS Statistics 19進行差異顯著性分析。

表2 qRT-PCR檢測GmSADs基因表達所用特異引物

1.2.6 大豆基因表達載體的構建

本試驗所用的植物表達載體pCAMBIA1303由CaMV35S啟動子驅動，含有卡那霉素抗性。將上述克隆載體pMD18-T-和pCAMBIA 1303分別用Ⅰ和Ⅰ進行雙酶切反應，酶切產物經回收純化后，用T4 DNA連接酶連接，得到重組表達載體(pCAMBIA1303-)。然后，將其轉入大腸桿菌，經PCR和雙酶切試驗鑒定陽性克隆。靶基因特異全長引物為GmSAD5-F：5′-ATGCCTCCAGAAAAGAAAGAAATTT-3′，GmSAD5-R：5′-TCACAAAAGCAATTCTTTATTG AAAATC-3′。

本試驗所用的酵母表達載體為pYES2.0，含位點和氨芐青霉素抗性。經過密碼子優(yōu)化的基因序列通過Ⅰ和Ⅰ雙酶切反應，連入pYES2.0中形成重組酵母表達載體pYES2.0-，轉到大腸桿菌DH5α并驗證成功。

1.2.7 大豆基因的煙草葉片瞬時表達和突變體酵母功能互補檢測

將上述構建成功的植物表達載體pCAMBIA 1303-通過凍融法轉入根癌農桿菌菌株GV3101。取六周齡煙草，按照Ji等方法將農桿菌沿煙草葉片主脈一側滲透注射，形成直徑約1 cm的斑塊，另一側以含空載體的菌株作為對照[35-36]。取侵染第3天的葉片提取RNA并檢測目的基因表達。取注射第6天的煙草葉片冷凍干燥后，用于提取總油脂和脂肪酸成分分析等。

缺陷型釀酒酵母菌株BY4389在含有0.01%油酸鈉的YPD培養(yǎng)基中于28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，當600為0.5左右時，離心收集細胞，用無菌水洗滌。根據醋酸鋰(LiAc) 轉化法，將上述構建成功的酵母表達載體pYES2.0-轉入BY4389缺陷酵母中，經過缺尿嘧啶(SC-URA)培養(yǎng)基篩選和PCR鑒定出陽性轉基因酵母。為了在釀酒酵母突變株中功能性表達，首先在SC-URA (含2%葡萄糖和0.01%油酸鈉) 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)上述陽性轉基因酵母。接著用不含油酸鈉且添加2%半乳糖的培養(yǎng)基誘導酵母細胞轉基因表達，28 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，5 000 r/min離心5 min收集酵母細胞，冷凍干燥后提取油脂和分析脂肪酸 成分。

1.2.8 脂肪酸甲酯提取與氣相色譜(GC) 分析

本試驗采用內標法對上述煙草葉片和酵母提取脂肪酸甲酯。稱取50 mg樣品研磨至粉末，加入50 μL的C17︰0作為內標(濃度為10 mg/mL)。用500 μL的2.5%的濃硫酸-甲醇混合液進行甲酯化，80 ℃水浴2 h。用氮吹儀吹干后，加入500 μL的正己烷溶解混勻。將樣品溶解液轉移到GC瓶中，用氣相色譜儀對樣品的脂肪酸成分及含量進行分析，試驗設置3個重復。脂肪酸含量通過安捷倫氣相色譜儀進行定性定量檢測，用毛細管柱(HP-88 100 m×0.25 mm×0.2 μm) 分離，火焰離子化檢測器測定。自動進樣，進樣次數為3，進樣量為1 μL；氮氣用作載氣，流速為2.64 mL/min；進樣溫度和前檢測器溫度均為250 ℃；采取程序升溫的方式：140 ℃的初始溫度保持5 min，然后以15 ℃/min的速度升至250 ℃。以樣品峰的保留時間與脂肪酸甲酯標準品的保留時間定性，按內標法計算各脂肪酸的含量。用下列公式計算各脂肪酸組分占樣品的百分含量(i)：

其中i為各脂肪酸組分；i為第i種脂肪酸組分的峰面積；s為內標的峰面積；s為內標的質量；為樣品質量。

1.2.9 總油脂提取與測定

采用氯仿-甲醇法提取煙草葉片的總油脂。稱取100 mg粉末置于離心管中(設置3個重復)，加入7.5 mL的氯仿-甲醇(1︰2)，混勻后于37 ℃抽提24 h。4 000 r/min離心10 min，收集上層有機相。向沉淀再次加入氯仿-甲醇重復抽提兩次，每次12 h。收集合并3次的有機相，加5 mL氯仿和 9 mL 1%的氯化鈉溶液，充分混勻后8 000 r/min離心10 min，回收下層有機相轉移至已知質量0(mg) 的玻璃管中，待管中液體蒸干后，稱取總重量1(mg)。

根據玻璃管質量0(mg) 和總重量1(mg) 計算煙草葉片中總脂的百分含量，即總脂的百分含量=(1?0)/樣品質量×100%。

2 結果與分析

2.1 大豆GmSADs基因家族的鑒定及基因結構和蛋白理化性質分析

利用擬南芥AtSADs蛋白序列(AtSSI2和AtSAD1–6) 搜索大豆數據庫，將獲得的候選序列通過SMART和CDD結構鑒定分析，最終共鑒定得到5個含有Acyl_ACP_Desat 保守結構域的GmSADs家族成員，且均屬于具有Fe-O-Fe中心的Ferritin-like鐵蛋白超家族，其行使催化反應需要借助鐵氧還蛋白NADP+氧化還原酶的電子傳遞系統(tǒng)。根據染色體定位信息，大豆基因被依次命名為–。利用在線GSDS2.0網站對基因進行內含子、外顯子分析。結果如圖1所示，的序列最長，且無5′和3′非翻譯區(qū)，所含外顯子(5個) 和內含子(4個) 數目最多。而和的基因不僅序列長度相近、均含有3個外顯子和2個內含子，且位置分布也相似。和的基因均含2個外顯子和1個內含子。

用ExPASy數據庫中的工具ProtParam對GmSADs家族成員的理化性質進行分析。結果如表3所示，這5個大豆SAD編碼蛋白長度范圍為337 aa (GmSAD5)–402 aa (GmSAD2)；相對分子質量在38.63 kDa (GmSAD5)–46.09 kDa (GmSAD2) 之間。除GmSAD3蛋白理論等電點為7.68外，其余成員的平均理論等電點為5.88。這5個GmSAD與擬南芥AtSSI2的理化性質相近。

圖1 大豆GmSADs的基因結構

表3 大豆GmSADs家族成員基本信息

C: chloroplast; –: any other location.

2.2 大豆GmSADs的蛋白結構分析

通過TMHMM Server v. 2.0、ChloroP 1.1和TargetP 1.1分別預測GmSADs家族成員的跨膜結構域和N-末端轉運肽(TP)，其中擬南芥AtSSI2作為對照。結果表明，GmSAD家族成員均不存在跨膜結構域。GmSAD1、GmSAD2和GmSAD3分別含有50、61和25個氨基酸的葉綠體轉運肽，類似于擬南芥AtSSI2。表明這3種蛋白可能在葉綠體中發(fā)揮作用，這與前人報道的SAD一般在細胞質體內進行脂肪酸催化反應相一致[37]。此外，這種葉綠體轉運肽也存在于其他植物的酰基- ACPΔ9去飽和酶中[32]。

根據SOPMA網站的預測結果，GmSAD成員的二級結構共有4種(圖2A)，其中α-螺旋與無規(guī)則卷曲的比例較高，β-轉角和擴展鏈比例較少。GmSADs各家族成員的二級結構α-螺旋的含量最高，其中GmSAD4和GmSAD5的α-螺旋比例分別為60.80%和61.72%，其余成員的比例平均約為52.38%；GmSADs成員的無規(guī)則卷曲比例范圍為25.22%–33.50%，β-轉角和擴展鏈結構的占比均小于10%。

用在線網站SWISS-MODEL對GmSADs家族成員進行三級結構預測分析并建模，結果如圖2B，預測到大豆GmSAD1蛋白活性形式為二聚體，每個單體的二級結構主要由11個α-螺旋、2個β-折疊和其他無規(guī)則卷曲組成，還含有1個由4個α螺旋束包圍的二鐵離子，F(xiàn)e離子的配基是四螺旋束的氨基酸側鏈，兩個單體的二鐵離子位于SAD二聚體底物結合凹槽的內部，共同組成了脫氫酶催化活性中心。

2.3 大豆GmSADs蛋白保守域及系統(tǒng)進化分析

利用GeneDoc軟件對大豆GmSADs蛋白家族進行多序列比對分析，選用對18:0-ACP具有底物選擇性的蓖麻RcSAD1 (NP_001310659.1) 和擬南芥AtSSI2作為對照。由圖3可知，大豆GmSADs家族序列與蓖麻RcSAD1、擬南芥AtSSI2蛋白的氨基酸序列相似性較高，而且其保守結構域類似于RcSAD1、AtSSI2，也分布在11個α螺旋和2個β片層之內[38-39]。前人研究表明，SAD脫氫酶的8個關鍵氨基酸種類影響著SAD對不同鏈長脂肪酰-ACP的選擇特異性。例如，蓖麻RcSAD1的關鍵氨基酸殘基(M114、L115、T117、L118、P179、T181、G188和F189) (圖3)和擬南芥AtSSI2 (M152、L153、T155、L156、P217、T219、G226和F227) 均能使二者特異性選擇并催化18︰0-ACP生成18︰1-ACP[40]。另外，將蓖麻RcSAD1的T117、L118、F189和T206突變?yōu)槠渌被?，則RcSAD1的催化底物由Δ9-18︰0-ACP改變?yōu)棣?-16︰0-ACP或烯丙醇反式異構體(E)-10-18︰1-9-OH[37,41]。多序列比對結果顯示，大豆GmSAD1和GmSAD2的關鍵氨基酸與RcSAD1和AtSSI2的完全相同，GmSAD5含有2個變異氨基酸(L86I，T88N)，GmSAD3和GmSAD4含有的變異氨基酸數目最多，分別為4 (M127I、L128M、T130G和T194F) 和5 (M142T、L143M、T145N、P207V和T209M)。推測這些GmSADs的催化功能可能在底物選擇方面存在差異。此外，GmSADs家族除了GmSAD4之外，還存在兩個具有典型SAD特征的保守的組氨酸富集區(qū)，即EENRHG和DEKRHE，其中天冬氨酸(D) 和組氨酸(H) 為GmSAD催化活性中心的二鐵離子提供了必需的結合位點，保證脫氫酶具備一定的催化活性。

圖2 大豆GmSADs蛋白的高級結構預測

圖3 大豆GmSADs的多序列比對

利用MEGA 7.0軟件對大豆GmSAD家族和其他植物SADs蛋白進行多序列系統(tǒng)進化分析。結果如圖4所示，GmSAD家族5個成員大致分為兩類：GmSAD1和GmSAD2與擬南芥AtSSI2、蓖麻RcSAD1、油菜BnSAD1等親緣關系較近，聚為一類；而GmSAD3、GmSAD4和GmSAD5則與擬南芥AtSAD6親緣關系較近。

2.4 大豆GmSADs家族成員的表達模式

為鑒定這些大豆家族成員是否行使功能，我們應用qRT-PCR分析這些基因的表達模式。結果如圖5所示，、和在所有組織中均高水平表達，其中和在根、莖、葉、花、果莢中表達量較高(圖5A和5B)，表明和可能在這些營養(yǎng)組織中發(fā)揮重要脫氫功能。和在各組織的表達量均極低(圖5C和5D)。重要的是，在發(fā)育種子中的表達量顯著高于在其他組織中的表達 (圖5E)，顯示其主要在種子中行使功能。對不同發(fā)育時期大豆種子檢測表明，隨著種子發(fā)育，表達快速升高，在大豆種子發(fā)育晚期的表達量達到峰值(圖5F)，而其他4個表達量極低。大豆種子發(fā)育中、晚期正是油脂積累高峰期，推測可能在大豆種子發(fā)育過程中參與油脂合成和儲存等重要過程。

圖4 大豆GmSADs蛋白與其他植物SAD(AtSSI2、AtSAD1–6、RcSAD1、BnSAD、 StSAD和TcSAD1)的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 大豆GmSAD5基因的克隆和表達載體構建

為解析編碼的酶蛋白是否具有SAD酶活性以及在大豆油脂生物合成中的功能，我們克隆了基因，并分別構建植物表達載體和酵母表達載體。以發(fā)育中晚期的大豆種子cDNA為模板，通過高保真PCR擴增出基因片段，經回收純化和測序驗證，成功克隆出。

利用Ⅰ和Ⅰ分別雙酶切上述基因片段和植物表達載體pCAMBIA1303，然后利用T4 DNA連接酶將二者進行連接，雙酶切驗證獲得重組植物表達載體pCAMBIA1303-。采用類似方法，構建了的酵母表達載體(pYES2.0-)。

圖5 大豆GmSADs基因在不同組織(A–E)和種子不同發(fā)育階段(F)的表達模式

2.6 大豆GmSAD5基因在煙草葉片的異源表達及對總油脂含量和脂肪酸成分的影響

利用農桿菌介導本氏煙草葉片瞬時表達基因，檢測過表達是否引起葉組織脂肪酸成分和油脂積累的改變。取注射2 d的葉片檢測的表達，結果如圖6A所示，轉基因煙草葉片能擴增出約1 014 bp的目的條帶，而轉空載的煙草葉片則無目的條帶，表明短時間內，基因在煙草葉片中得以有效表達。取注射6 d的葉片進行總脂檢測(圖6B) 顯示，轉基因煙草葉片的總脂含量明顯比野生型和轉空載的煙葉高2.73%和2.80%。脂肪酸成分分析(圖6C) 表明，與野生型和轉pCAMBIA1303空載的煙草葉片相比，轉煙草葉片的不飽和油酸(C18︰1) 和亞油酸(C18︰2) 分別增加了5.56%和8.14%，而C16︰0、C18︰0、C18︰3和C20︰0的含量均降低，尤其是硬脂酸(C18︰0)，下降了約2.46%。另外，亞麻酸(C18︰3) 的含量也明顯下降了約10.29%?？傊?，能夠提高煙草葉片中總脂的含量，其中飽和脂肪酸(尤其是硬脂酸) 含量顯著降低，不飽和油酸(C18︰1) 含量顯著增加。這表明GmSAD5在煙葉組織中能行使SAD功能，催化18︰0-ACP生成18︰1-ACP，且促進總油脂的積累。

2.7 大豆GmSAD5基因在SAD缺陷酵母中的異源表達及對脂肪酸成分的影響

在不飽和脂肪酸合成缺陷的釀酒酵母(BY4389) 中異源表達基因，轉化酵母經缺尿嘧啶培養(yǎng)基篩選和PCR檢測分析(圖7A)顯示，轉基因酵母均擴增出大小為1 014 bp的條帶，且能夠在不含油酸的培養(yǎng)基中正常生長擴繁。然而，缺陷型和轉空載的酵母則無法正常生長。這表明轉基因酵母能夠合成不飽和脂肪酸并滿足自身生長需求，證明具有SAD酶活性。經氣相色譜進一步檢測酵母細胞脂肪酸成分，發(fā)現(xiàn)轉基因酵母經半乳糖誘導表達后合成的棕櫚酸(C16︰0) 和硬脂酸(C18︰0) 含量均明顯下降了約4.19%和7.46% (圖7B)，但是產生了大量的單不飽和油酸(C18︰1，約10.72%) 和少量棕櫚油酸(C16︰1)。而缺陷型和轉空載酵母均不含上述不飽和脂肪酸(圖7B)。這表明GmSAD5確實能使缺陷型酵母生成不飽和脂肪酸，且主要選擇硬脂酰-ACP (18︰0-ACP) 為底物并催化其脫氫形成油酰-ACP (18︰1-ACP)。

圖6 轉GmSAD5基因煙草葉片中的目的基因表達分析(A)、總脂質含量(B)和脂肪酸譜(C)

圖7 GmSAD5基因在缺陷酵母BY4389中的異源表達及對脂肪酸成分的影響

3 討論

大豆作為我國農業(yè)的主要經濟作物之一，除了為人們提供豆類蛋白之外，還是人們日常生活食用植物油的主要來源之一[42]。盡管大豆油含量較高，在食品加工業(yè)應用廣泛，但高含量的多不飽和脂肪酸增加容易使大豆油氧化酸敗，從而限制了大豆油食用價值和利用率。而高油酸大豆油兼具飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸特性，氧化穩(wěn)定性強，長期食用能夠減少人體有害膽固醇并使人體內的有益膽固醇得到很好地保持，從而可減少心腦血管等疾病的發(fā)生。因此，探究大豆硬脂酰-ACP Δ9脫氫酶的催化活性以解析油酸分子合成機制并為后續(xù)通過轉基因工程培育高油酸大豆具有重要的指導意義。

本研究從大豆基因組鑒定獲得5個GmSAD家族成員，預測到這些酶均以同型二聚體形式存在，每個單體含有一個二鐵中心，且含一個屬于類鐵蛋白家族和屬于酰基-ACP脫氫酶家族的保守結構域，此外，由2個鐵原子組成的二鐵中心包裹于４螺旋束中。硬脂酰-ACPΔ9脫氫酶(SAD)是一種脫氫酶，在將油中的飽和脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸中起關鍵作用，大豆GmSADs家族中這5個大豆基因的內含子數目差異較大，如有4個內含子，和基因僅有1個內含子。GmSADs成員在編碼蛋白長度、相對分子量、理論等電點等理化性質也隨著基因編碼序列的長短和堿基比例不同而表現(xiàn)出不同的差異，如GmSAD5編碼蛋白長度為337 aa，相對分子量為38.63 kDa，二級結構的α螺旋含量最高，分布較為均勻；而GmSAD2編碼蛋白序列最長(402 aa)，相對分子質量也較大(46.09 kDa)，二級結構的α螺旋含量相對較少，在序列中間分布密集。

時空表達分析揭示，這些基因在大豆根、莖、葉、花、果莢和不同發(fā)育時期的豆子中都具有不同的表達模式。和在大豆各組織中均有表達，而只有在整個發(fā)育階段的大豆種子，特別是在中晚期具有極高的表達量，且與種子油脂積累時期相吻合。這表明主要在發(fā)育種子中行使功能，在種子油脂積累中起重要作用。與之相似的是，Zhang等報道，可可在發(fā)育胚中的表達量較高，TcSAD1能提高擬南芥突變體種子的油酸(18︰1Δ9) 含量，其功能類似于擬南芥AtSSI2[23]。

已有研究表明，SAD酶蛋白催化中心的8個關鍵氨基酸可能決定著SAD的底物特異性。這8個關鍵氨基酸殘基種類發(fā)生改變時常導致該脫氫酶對底物選擇活性的改變。例如，擬南芥AtSSI2這8種關鍵氨基酸依次為M152、L153、T155、L156、P217、T219、G226和F227，AtSSI2則對18︰0-ACP選擇活性遠遠高于16︰0-ACP；當T219突變?yōu)镕219時，其對16︰0-ACP的選擇活性遠遠高于18︰0-ACP。然而，AtSSI2蛋白P217突變?yōu)镾217，則不影響AtSSI2對18︰0-ACP的選擇活性[40,43]。同樣，貓爪草MucACP-Δ9脫氫酶對16︰0-ACP有特異的選擇活性，其僅在和AtSSI2脫氫酶L156的對應位置處含有一個變異氨基酸，即L152W[40]。序列分析表明，GmSAD5在與AtSSI2的L153和T155對應位置處也含有兩個變異的關鍵氨基酸(L86I和T88N)。通過基因煙草葉片瞬時表達和缺陷型酵母遺傳轉化測試顯示，GmSAD5仍表現(xiàn)出對18︰0-ACP的特異選擇性。這表明，并非所有SAD的底物選擇性都由SAD酶蛋白催化中心這8個關鍵氨基酸決定，這8個關鍵氨基酸及其相鄰氨基酸的空間排列構型也可能控制著催化底物的選擇性。值得注意的是，農桿菌介導的煙草瞬時表達是一種常用的鑒別目標基因功能方法，具有簡單、快速、周期短、生物安全性高等優(yōu)點。但有時不能反映所測目的基因功能的全貌，所測表型的變化準確性也受到接種量的多少、葉片的生理狀況及環(huán)境條件等因素影響。進一步論證基因功能，還需要進行種子特異過表達該基因，或沉默及敲除該基因及該基因家族其他成員的遺傳轉化試驗。本研究鑒定獲得5個GmSAD 特別是GmSAD5分子克隆可作為大豆油脂品質改良及油脂合成途徑基因修飾的優(yōu)異靶標。

4 結論

本研究鑒定獲得5個大豆GmSAD家族成員，預測分析表明，均具有Fe-O-Fe中心和SAD酶特有的兩個保守組氨酸富集基序(EENRHG和DEKRHE)，為同源二聚體活性酶蛋白。五個基因在大豆各組織中表達模式不同，其中在發(fā)育種子中晚期高量表達，與大豆油脂快速積累時期相吻合。煙草葉片瞬時表達和酵母突變體功能互補測試表明GmSAD5能高效催化硬脂酸生成油酸，促進細胞總油脂合成積累。本研究為解析大豆種子油脂生物合成調控機制和大豆油脂品質改良提供了新知識和優(yōu)異分子靶標。

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Identification and functional analysis of soybean stearoyl-ACP Δ9desaturase () gene family

Mimi Deng1,2, Baoling Liu2, Zhilong Wang2, Jin’ai Xue2, Hongmei Zhang1, and Runzhi Li2

1College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China 2Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China

Stearoyl-ACP Δ9desaturase (SAD) catalyzes the synthesis of monounsaturated oleic acid or palmitoleic acid in plastids. SAD is the key enzyme to control the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids in plant cells. In order to analyze the regulation mechanism of soybean oleic acid synthesis, soybean () GmSAD family members were genome-wide identified, and their conserved functional domains and physicochemical properties were also analyzed by bioinformatics tools. The spatiotemporal expression profile of each member of GmSADs was detected by qRT-PCR. The expression vectors ofwere constructed. The enzyme activity and biological function of GmSAD5 were examined by-mediated transient expression inleaves and genetic transformation of oleic acid-deficient yeast () mutant BY4389. Results show that the soybean genome contains five GmSAD family members, all encoding an enzyme protein with diiron center and two conservative histidine enrichment motifs (EENRHG and DEKRHE) specific to SAD enzymes. The active enzyme protein was predicted as a homodimer. Phylogenetic analysis indicated that five GmSADs were divided into two subgroups, which were closely related toand, respectively. The expression profiles ofmembers were significantly different in soybean roots, stems, leaves, flowers, and seeds at different developmental stages. Among them,expressed highly in the middle and late stages of developmental seeds, which coincided with the oil accumulation period. Transient expression ofin tobacco leaves increased the oleic acid and total oil content in leaf tissue by 5.56% and 2.73%, respectively, while stearic acid content was reduced by 2.46%. Functional complementation assay in defective yeast strain BY4389 demonstrated that overexpression ofwas able to restore the synthesis of monounsaturated oleic acid, resulting in high oil accumulation. Taken together, soybean GmSAD5 has strong selectivity to stearic acid substrates and can efficiently catalyze the biosynthesis of monounsaturated oleic acid. It lays the foundation for the study of soybean seed oleic acid and total oil accumulation mechanism, providing an excellent target for genetic improvement of oil quality in soybean.

soybean (), stearoyl-acyl carrier protein Δ9desaturase (SAD), functional analysis, oleic acid, oil quality

December 11, 2019;

February 2, 2020

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31401430, 31201266, 30971806), National Department of Agriculture “948” Program (No. 2014-Z39), Coal-based Key Sci-Tech Project of Shanxi Province, China (No. FT-2014-01), Key Project of the Key Research and Development Program of Shanxi Province, China (No. 201603D312005), Key Research and Development Project of Shanxi Province (No. 201703D221002-3), Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (No. 2015-064).

Hongmei Zhang. Tel: +86-354-6286908; E-mail: tgzhhm@163.com

Runzhi Li. Tel: +86-354-6288344; E-mail: rli2001@126.com

國家自然科學基金 (Nos. 31401430，31201266，30971806)，國家農業(yè)部“948”項目 (No. 2014-Z39)，山西省煤基重點科技攻關項目 (No. FT-2014-01)，山西省重點科技項目 (No. 201603D312005)，山西省重點研發(fā)計劃 (No. 201703D221002-3)，山西省留學歸國人員科研基金 (No. 2015-064) 資助。

2020-03-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20200309.1006.001.html

10.13345/j.cjb.190550

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(本文責編 郝麗芳)