金竹萍，李澄，王磊，裴雁曦

·生物技術(shù)與方法·

擬南芥表皮模式因子EPFs的表達純化與功能鑒定

金竹萍，李澄，王磊，裴雁曦

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 特色植物資源研究與利用山西省重點實驗室，山西 太原 030006

氣孔密度是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的重要形態(tài)學(xué)指標。文中以擬南芥氣孔發(fā)育相關(guān)的表皮模式因子 (EPFs) 為研究對象，構(gòu)建原核表達載體并進行蛋白表達和純化，并與新型氣體信號分子硫化氫 (H2S) 建立聯(lián)系。首先克隆基因、和，構(gòu)建pET28a表達載體；然后對重組質(zhì)粒pET28a-、pET28a-和pET28a-進行酶切檢測和測序，結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功；分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3) 進行異丙基β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 誘導(dǎo)表達。優(yōu)化后的表達條件：IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.5、0.3、0.05 mmol/L；最適誘導(dǎo)溫度分別為28 ℃、28 ℃和16 ℃；最適誘導(dǎo)時間分別為16 h、16 h和20 h；經(jīng)Ni瓊脂糖凝膠柱純化獲得融合蛋白，大小分別為18 kDa、19 kDa和14.5 kDa左右。將純化到的AtEPF2和AtEPFL9蛋白分別處理擬南芥幼苗，與對照相比，其H2S產(chǎn)率均有不同程度的變化，且差異顯著。即表皮模式因子AtEPFs影響植物內(nèi)源H2S信號的產(chǎn)生。為后續(xù)深入研究H2S和EPFs對植物氣孔發(fā)育影響的作用機制奠定基礎(chǔ)，對增加作物產(chǎn)量、增強植物抗逆性有重要意義。

硫化氫，氣孔發(fā)育，表皮模式因子，載體構(gòu)建，蛋白純化，擬南芥

氣孔是由2個保衛(wèi)細胞包圍而成的開孔，多存在于葉片和莖，是植物表皮所特有的結(jié)構(gòu)。氣孔密度直接決定植物葉片進行光合作用的效率和作物產(chǎn)量，因此是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一個很重要的形態(tài)學(xué)指標。有資料表明，氣孔的產(chǎn)生早于植物的維管、根、種子和花等其他組織器官，充分說明了氣孔在植物的生長發(fā)育中的重要作用[1]。氣孔的發(fā)育遵循“單細胞間隔”原則，由植物的原表皮細胞開始，以不均等間隔分裂的方式組成了葉片表皮細胞的關(guān)鍵部分[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在模式植物擬南芥中表皮模式因子 (Epidermal pattern factors，EPFs) 家族基因編碼細胞分泌型的、富集半胱氨酸的短肽，它們的生物功能大多被證明為調(diào)節(jié)氣孔的發(fā)育及植物的生長[4-5]。其中已經(jīng)明確功能的是，EPF1與EPF2在氣孔發(fā)育調(diào)節(jié)中為負調(diào)控因子，EPFL9為正調(diào)控因子[6-8]，即EPF1和EPF2抑制氣孔發(fā)育，而EPFL9促進氣孔的發(fā)育。氣孔的發(fā)育在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為氣孔數(shù)目和保衛(wèi)細胞大小兩個方面，決定著植物體光合與呼吸時CO2和O2的進出速度，從而調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫的響應(yīng)，最終影響農(nóng)作物產(chǎn)量[9]。

硫化氫 (Hydrogen sulfide，H2S) 是近年來備受矚目的一種新型氣體信號分子，參與動植物體內(nèi)很多生理過程，執(zhí)行非常重要的生理功能。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，H2S通過與其他植物激素相互作用，共同調(diào)節(jié)氣孔運動，參與植物對干旱脅迫的響應(yīng)[10-17]。在實驗過程中，同時發(fā)現(xiàn)H2S處理對植物氣孔的數(shù)目和大小也有影響。因此，H2S和EPFs在調(diào)控植物氣孔發(fā)育中的作用有相似之處。本研究構(gòu)建擬南芥表皮模式因子編碼基因、和的原核表達載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達純化得到融合蛋白。將純化到的蛋白分別處理擬南芥幼苗，測定其體內(nèi)的H2S產(chǎn)率變化，為后續(xù)開展氣體信號H2S和EPFs對擬南芥葉片氣孔發(fā)育調(diào)節(jié)機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

擬南芥(, Col-0) 植株，原核表達載體pET28a (Kan抗性)，大腸桿菌菌株DH5α及BL21(DE3) 菌株，由實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

實驗過程中所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (5×All-In-One RT MasterMix(abm))、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、提質(zhì)粒試劑盒、限制性內(nèi)切酶 (HⅠ/Ⅰ)、Ligation-Free Cloning System (abm)、甘油、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母提取物、瓊脂粉、卡那霉素 (Kan)、異丙基β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、引物合成等，均購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

PCR基因擴增儀 (杭州博日 TC-96/G/H9(b))、凝膠成像系統(tǒng)儀(BIO-RAD 1708195)、高速離心機 (安徽中科中佳HC-2062)、無菌操作工作臺 (北京京儀VS-1300L-U)、紫外分光光度計 (上海尤尼柯UV-2100)、核酸電泳儀 (北京六一儀器廠DYY-8C)、恒溫振蕩器 (太華THZ-C)、壓力蒸汽滅菌鍋 (上海博迅YXQ-LS-70A)、電熱恒溫水浴鍋 (恒字XMTD-8222)、超聲破碎儀 (寧波新芝JY88-IIN) 等。

1.2 方法

1.2.1、和基因的克隆及pET28a載體的雙酶切

以4周齡的野生型擬南芥葉片為實驗材料，采用異硫氰酸胍/苯酚法提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的(At2g20875)、(At1g34245)和(At4g12970)序列，設(shè)計兩端分別含有HⅠ和Ⅰ酶切位點的引物，引物序列見表1。

首先，以反轉(zhuǎn)錄得到的擬南芥cDNA為模板，克隆、和基因。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆產(chǎn)物，檢測正確后切膠回收。同時，將pET28a載體質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HⅠ和Ⅰ 37 ℃雙酶切處理3 h，得到線性化載體產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，切膠回收待用。

1.2.2 pET28a-、pET28a-和pET28a-重組質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建

分別取目的基因 (、和) 2 μL、雙酶切線性化載體片段 (pET28a) 6 μL和無縫連接酶 (5×ligation-free cloning master mix) 2 μL。再把目的基因 (、和) 分別與雙酶切線性化載體片段和無縫連接酶輕輕混勻，冰上放置30 min，得到連接產(chǎn)物。

把連接后的產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)過夜，挑選菌落進行PCR鑒定，將大小正確的條帶切膠回收，測序檢測。

1.2.3 pET28a-、pET28a-和pET28a-原核表達載體的誘導(dǎo)表達

1) 提取重組質(zhì)粒pET28a-、pET28a-和pET28a-，分別轉(zhuǎn)化于BL21感受態(tài)細胞中。37 ℃培養(yǎng)過夜后，分別挑選單菌落在LB液體培養(yǎng)基 (Kan抗性) 中，37 ℃、 180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

2) 預(yù)誘導(dǎo)菌株摸索蛋白誘導(dǎo)表達條件：將培養(yǎng)的菌液按1%的比例接入含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，約3–5 h后，紫外分光光度測得菌液的600在0.6–0.8之間，加IPTG 至終濃度分別為0、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5 mmol/L，分別在16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h 、28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h、37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h后取樣。

表1 引物序列

The single underlined sequences indicate restriction enzyme site.

3) 處理樣品：取不同溫度和不同誘導(dǎo)濃度下BL21(DE3)/pET28a-、BL21(DE3)/pET28a-和BL21(DE3)/pET28a-菌株的樣品各5 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入0.1 mol/L磷酸緩沖液 (1×PBS) 500 μL重懸菌體沉淀，超聲波 (5 s/5 s) 破碎菌體，12 000 r/min離心1 min，取上清，加入5×上樣緩沖液 (含有β-巰基乙醇) 混勻，100 ℃煮沸8 min使蛋白質(zhì)變性，12% SDS-PAGE檢測。

4) 篩選EPF1、EPF2和EPFL9蛋白誘導(dǎo)表達條件：在0、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度下，16 ℃、28 ℃和 37 ℃三種不同誘導(dǎo)溫度條件下進行蛋白的誘導(dǎo)表達，分別誘導(dǎo)16、16、20 h后取樣品進行SDS-PAGE檢測。最終篩選出誘導(dǎo)蛋白最適條件為：IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.5、0.3、0.05 mmol/L，最適誘導(dǎo)溫度分別為28 ℃、28 ℃和16 ℃，最適誘導(dǎo)時間分別為16、16和20 h。

1.2.4 AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白的純化

取構(gòu)建好的BL21(DE3)/pET28a-、BL21(DE3)/pET28a-和BL21(DE3)/pET28a-菌株在固體LB平板 (Kan抗性) 上劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜；挑取單菌落接種至1 mL Kan抗性LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；再取100 μL菌液接種至100 mL Kan抗性的液體LB培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)約3–5 h后，至600在0.6–0.8之間，分別加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L、0.3 mmol/L和0.05 mmol/L，誘導(dǎo)溫度分別為28 ℃、28 ℃和16 ℃，誘導(dǎo)時間分別為16、16和20 h。同時分別在相同的溫度和誘導(dǎo)時間下設(shè)置對照組， 12 000 r/min離心1 min，倒棄培養(yǎng)液上清，留下菌體沉淀，冰上放置待用[18]。

將5 mL 20 mmol/L的咪唑加入到集菌管內(nèi)，吹吸沉淀，直至成為均勻的乳白色液體。然后將其置于冰上超聲破碎至透明狀態(tài)；12 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄掉沉淀；用注射器吸取上清，通過濾膜緩慢注入Ni瓊脂糖凝膠柱，靜置10 min，使蛋白與Ni柱充分結(jié)合，然后流出蛋白，以上過程重復(fù)3次；直至Ni瓊脂糖凝膠柱中蛋白完全流出后，用含梯度濃度的咪唑洗脫液 (濃度依次為20、50 、100、200、250、300、500 mmol/L) 洗脫蛋白。最終AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋 白能被洗脫下來的咪唑濃度為200、100和 200 mmol/L。

1.2.5 AtEPF2和AtEPFL9蛋白對擬南芥H2S產(chǎn)率的影響

野生型擬南芥種子消毒后播種于1/2MS培養(yǎng)基表面，直立培養(yǎng)2周后分別加入5 mL的AtEPF2和AtEPFL9蛋白 (濃度為0.2 μg/μL)，輕輕晃動以使擬南芥幼苗充分浸潤在蛋白液體中。咪唑洗脫液為對照處理，分別在處理1、3、5、7、9、10、30 min時取樣，測定幼苗的H2S產(chǎn)率，H2S產(chǎn)率測定方法參照文獻[10]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9的克隆

以4周苗齡的葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照表1設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)，克隆得到目的基因、和。結(jié)果如圖1所示，、和的大小分別為252 bp、285 bp、213 bp圖1A–1C)。

圖1 pET28a-AtEPF1、pET28a-AtEPF2和pET28a-AtEPFL9重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 DH5α/pET28a-AtEPF1、DH5α/pET28a- AtEPF2和DH5α/pET28a-AtEPFL9的菌液PCR

將1.2.2方法中所得含有pET28a-、pET28a-和pET28a-的DH5α菌株進行PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示。成功克隆到目的基因、和，分別與預(yù)期大小一致 (圖1D–1F)。

2.3 pET28a-AtEPF1、pET28a-AtEPF2和pET28a-AtEPFL9重組質(zhì)粒的雙酶切檢測

按照提質(zhì)粒試劑盒的使用說明，分別提取DH5α/pET28a-DH5α/pET28a-和DH5α/pET28a-菌株的重組質(zhì)粒。將回收到的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HⅠ和Ⅰ在37 ℃條件下酶切3 h，結(jié)果如圖1所示。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切得到目的片段的大小分別與、和基因一致(圖1G–1I)。結(jié)合2.2的檢測結(jié)果，說明重組載體pET28a-、pET28a-和pET28a-構(gòu)建成功。

2.4 AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白的純化

按照1.2.3中篩選到的最適誘導(dǎo)表達蛋白條件，誘導(dǎo)BL21(DE3)/pET28a-、BL21(DE3)/ pET28a-和BL21(DE3)/pET28a-表達蛋白。按照1.2.4的純化蛋白步驟，分別純化到AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白。但大小與預(yù)期不一致 (圖2A–2C)，分別約為理論計算值的2倍。經(jīng)Ni瓊脂糖凝膠柱純化獲得融合蛋白，大小分別為18 kDa、19 kDa和14.5 kDa左右。

2.5 AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白的生物信息學(xué)分析

通過ProtScale在線軟件分別對AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白親疏水特性進行分析，得到其蛋白親疏水性預(yù)測圖 (圖3A–3C)，正值的氨基酸表明具有疏水性，負值的氨基酸表明具有親水性。正值越大，則蛋白質(zhì)的疏水性越強；負值越小，則蛋白質(zhì)的親水性越強。分析發(fā)現(xiàn)，AtEPF1和AtEPF2蛋白親疏水特性趨勢一致，AtEPFL9蛋白氨基酸負值數(shù)目遠遠多于正值數(shù)目，即AtEPFL9蛋白親水性較強。這與在實驗過程中純化AtEPFL9蛋白時，菌體沉淀較易破碎，上清溶液中蛋白濃度較高相一致。

通過在線SWISS MODEL軟件，對AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白三維結(jié)構(gòu)進行模擬，同源建模預(yù)測結(jié)果100%，如圖3D–3F所示。分析發(fā)現(xiàn)，AtEPF1和AtEPF2的結(jié)構(gòu)是類似的，這與AtEPF1和AtEPF2在植物氣孔發(fā)育過程中的功能一致相吻合，進一步印證了蛋白質(zhì)的“結(jié)構(gòu)決定功能”的事實。

2.6 AtEPF2和AtEPFL9蛋白處理后擬南芥的H2S產(chǎn)率測定

在用AtEPF2和AtEPFL9 蛋白處理擬南芥后，測定了不同處理時間H2S的產(chǎn)率，結(jié)果如圖4所示。(1) 以咪唑洗脫液為對照，用AtEPF2蛋白處理擬南芥后，在處理時間為1、3、5、7、10 min時，與對照相比，擬南芥的H2S產(chǎn)率均有不同程度的下降，且有顯著性差異。而在處理時間為30 min時，與對照相比，擬南芥的H2S產(chǎn)率沒有明顯變化。(2) 以咪唑洗脫液為對照，用AtEPFL9蛋白處理擬南芥后，在處理時間為1、3、5、7、10 min時，與對照相比，擬南芥的H2S產(chǎn)率均有不同程度的上升，且有顯著性差異。而在處理時間為30 min時，與對照相比，擬南芥的H2S產(chǎn)率沒有明顯變化。

圖2 SDS-PAGE分析大腸桿菌中AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白的表達純化

圖3 AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白的生物信息學(xué)分析

圖4 AtEPF2和AtEPFL9蛋白處理對擬南芥H2S產(chǎn)率的影響

3 討論

氣孔是地球上任何植物不可缺少的重要組成部分。在眾多糧食作物中，如大麥、玉米、高粱等，它們通過氣孔實現(xiàn)氣體交換，進行光合作用來制造有機物。因此，氣孔發(fā)育、氣孔數(shù)目和氣孔大小是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的一個重要的形態(tài)學(xué)指標。構(gòu)建擬南芥氣孔發(fā)育基因、和原核表達載體及開展后續(xù)一系列研究，為進行基礎(chǔ)農(nóng)作物氣孔發(fā)育的研究建立了良好的開端。同時，這也為H2S調(diào)控氣孔發(fā)育增強農(nóng)作物光合作用來提高產(chǎn)量提供了一種可能的途徑。

在克隆得到目的基因時，和基因的大小與預(yù)期大致吻合，基因的大小略大于理論值 (圖1C)。分析發(fā)現(xiàn)，由于片段較小，而瓊脂糖凝膠電泳時所加的染料分子量較大，會對基因的電泳結(jié)果略有影響。通過堿基數(shù)目換算氨基酸數(shù)目公式，理論上得到的AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9表達后的融合蛋白大小約為9.13 kDa、10.34 kDa、 7.7 kDa。而SDS-PAGE顯示表達后的融合蛋白大小約為18 kDa、19 kDa、14.5 kDa。雖然AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白與pET28a載體上的His標簽蛋白進行融合表達，但His標簽蛋白的大小約為0.6 kDa，理論上不足以影響SDS-PAGE結(jié)果。通過在線SWISS MODEL軟件，對3種蛋白三維結(jié)構(gòu)進行模擬，deepview分析了蛋白表面電荷分布情況，發(fā)現(xiàn)3個蛋白表面的正電荷和負電荷均分別集中分布在蛋白的兩端，這意味著AtEPF1、AtEPF2和AtEPFL9蛋白在SDS-PAGE過程中，極易通過電荷之間“異性相吸”原理，形成二聚體或多聚體。因此，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示的蛋白大小與理論計算值相比，可能為多聚體形式。

EPFs家族屬于多肽類激素[5]，因此用純化得到的AtEPF2和AtEPFL9融合蛋白處理擬南芥幼苗。在處理時間分別為1、3、5、7、10 min時，與對照相比，它們的H2S產(chǎn)率均有不同程度的變化，EPF2和EPFL9分別抑制和促進H2S的產(chǎn)生 (圖4)。而處理時間延長至30 min時，H2S產(chǎn)率與對照組相比無顯著變化。這說明AtEPF2和AtEPFL9 蛋白作為多肽類激素，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)H2S的產(chǎn)生，且只在短時間內(nèi)發(fā)揮作用，隨著處理時間的延長作用逐漸消失。我們已經(jīng)知道，EPF1和EPF2在調(diào)控氣孔發(fā)育中均表現(xiàn)為抑制作用[5]且兩種蛋白的三維結(jié)構(gòu) (圖3D和3E) 極其類似。但在實驗過程中，與EPF2不同的是，EPF1蛋白的純化遇到各種各樣的困難，這可能與EPF1本身表達很少，且EPF1蛋白極易以包涵體的形式存在有關(guān)。但從理論上推測，EPF1的作用應(yīng)當(dāng)與EPF2類似，也可能抑制植物體內(nèi)H2S的產(chǎn)生。

EPF1、EPF2和EPFL9蛋白是EPFs家族中功能較為明確的分泌型多肽激素，它們調(diào)節(jié)葉片氣孔的生長與發(fā)育[5]，然而其更深層次的作用機理尚不明確。本研究表達純化這3種蛋白，為深入研究它們的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)[19]。令人興奮的是，初步研究結(jié)果表明，EPFs融合蛋白顯著調(diào)控植物體內(nèi)H2S信號的生物合成。因此，進一步深入研究EPFs和H2S對植物氣孔發(fā)育的作用機制，對農(nóng)業(yè)實踐中增加作物產(chǎn)量、增強植物抗逆性有重要意義。

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Prokaryotic expression, purification and functional identification of epidermal pattern factors in

Zhuping Jin, Cheng Li, Lei Wang, and Yanxi Pei

,,,030006,,

Stomatal density is important for crop yield. In this paper, we studied the epidermal pattern factors (EPFs) related to stomatal development. Prokaryotic expression vectors were constructed to obtain EPFs. Then the relationship between EPFs and hydrogen sulfide (H2S) was established. First,,andwere cloned and constructed to pET28a vectors. Then recombinant plasmids pET28a-, pET28a-and pET28a-were digested and sequenced, showing successful construction. Finally, they were transformed intoBL21(DE3) separately and induced to express by isopropyl β-D-galactoside (IPTG). The optimized expression conditions including IPTG concentration (0.5, 0.3 and 0.05 mmol/L), temperature (28 °C, 28 °C and 16 °C) and induction time (16 h, 16 h and 20 h) were obtained. The bands of purified proteins were about 18 kDa, 19 kDa and 14.5 kDa, respectively. In order to identify their function, the purified AtEPF2 and AtEPFL9 were presented toseedlings. Interestingly, the H2S production rate decreased or increased compared with the control, showing significant differences. That is, EPFs affected the production of endogenous H2S in plants. These results provide a foundation for further study of the relationship between H2S and EPFs on stomatal development, but also a possible way to increase the yield or enhance the stress resistance.

hydrogen sulfide, stomatal development, epidermal pattern factor, vector construction, protein purification,

June 27, 2019;

August 8, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31671605, 31672140).

Yanxi Pei. Tel: +86-351-7018161; E-mail: peiyanxi@ sxu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31671605, 31672140) 資助。

2019-09-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190904.1625.001.html

10.13345/j.cjb.190285

金竹萍, 李澄, 王磊, 等. 擬南芥表皮模式因子EPFs的表達純化與功能鑒定. 生物工程學(xué)報, 2020, 36(4): 792–800.

Jin ZP, Li C, Wang L, et al. Prokaryotic expression, purification and functional identificationof epidermal pattern factors in. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 792–800.

(本文責(zé)編 陳宏宇)