王先菊，李 瑋，杜洪志，吳珊珊，侯曉杰，熊 瑞，張 敏，劉婭琴，李 妍

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

續(xù)斷是我國常用的傳統(tǒng)中藥材之一，該品為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根[1]。味辛、苦，微溫。歸肝、腎經(jīng)。具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏的功效[2-3]。其主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂苷類等[4-6]。續(xù)斷主要以野生為主，在我國湖北、湖南、江西、四川、貴州、云南、廣西、西藏等省區(qū)均有分布[7]。貴州已經(jīng)建立許多規(guī)?；m(xù)斷種植基地，如貴陽、六盤水、銅仁、畢節(jié)等地，種植面積3萬余畝，產(chǎn)量接近2.5萬噸，續(xù)斷藥材除了進行飲片生產(chǎn)之外，也是貴州同濟堂制藥有限公司的主打產(chǎn)品“仙靈骨葆膠囊”(批注文號：國藥準(zhǔn)字Z20025337)中主要藥物配方之一。本項目有規(guī)范化、規(guī)?；乃幉姆N植基地，生產(chǎn)企業(yè)，飲片市場用藥支撐，為研究成果的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供堅實保障，同時，為企業(yè)解決生產(chǎn)中存在的問題，規(guī)范生產(chǎn)，有助于貴州品牌飲片及品牌中成藥的形成。

2015版《中國藥典》中收載的續(xù)斷炮制方法有酒炙法、鹽炙法，其工藝均為傳統(tǒng)手藝，無具體的工藝技術(shù)參數(shù)，不便于控制飲片的質(zhì)量，不利于實際生產(chǎn)。因此，本研究以續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷VI為指標(biāo)成分，采用正交試驗制定工藝技術(shù)參數(shù)，為企業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 儀器、試劑

1.1 儀器

JA2003型千分之一電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；ME204E型萬分之一電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；ZT-150型 高速多功能粉碎機(永康市展帆市工貿(mào)有限公司)；HS10260D型超聲波清洗機(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；CS101-1C型鼓風(fēng)干燥箱(重慶四達實驗儀器廠)；高效液相色譜儀(規(guī)格型號：U3000，廠家：賽默飛世爾科技公司)； SZ-96自動純水蒸餾器(上海亞榮生儀器廠)。

1.2 試劑

乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：2017.06.21，色譜純)；甲醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號：2017.08.01，分析純)；純凈水(娃哈哈)；川續(xù)斷皂苷VI(購自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，批號：CAS No：39524-08-8，純度>98%)；續(xù)斷藥材購自貴州省貴陽市修文縣龍場鎮(zhèn)原慶文廠。

2 方法

2.1 炮制方法

1)水洗量的考察。取續(xù)斷原藥材，除去雜質(zhì)，分成5份，稱重，分別加入藥重的2倍、4倍、6倍、8倍、10倍水量洗30 min，切成4 mm厚片，在60 ℃下干燥至同等干燥程度。

2)水洗時間的考察。取續(xù)斷原藥材，除去雜質(zhì)，分成5份，稱重，加入藥重的6倍水量分別浸潤10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，切成4 mm厚片，在60 ℃下干燥至同等干燥程度。

3)浸潤水量的考察。取續(xù)斷原藥材，除去雜質(zhì)，分成5份，稱重，分別加入藥重的2倍、4倍、6倍、8倍、10倍水量浸潤2 h，切成4 mm厚片，在60 ℃下干燥至同等干燥程度。

4)浸潤時間的考察。取續(xù)斷原藥材，除去雜質(zhì)，分成5份，稱重，加入藥重的10倍水量分別浸潤2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，切成4 mm厚片，在60 ℃下干燥至同等干燥程度。

5)干燥溫度的考察。取續(xù)斷原藥材，除去雜質(zhì)，分成3份，稱重，每份200 g加入藥重的8倍水量浸潤10 h，切成4 mm厚片，分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃下干燥至同等干燥程度。

6)切片長度的考察。取續(xù)斷原藥材，除去雜質(zhì)，分成3份，稱重，每份200 g加入藥重的2倍水量浸潤6 h，分別切成3 mm、4 mm、5 mm厚片，分別在60 ℃下干燥至同等干燥程度。

2.2 正交試驗

按 L9(34)設(shè)計研究續(xù)斷生品炮制最佳工藝條件。試驗因素及水平見表1

表1 因素水平表Tab.1 Factor levels

2.3 川續(xù)斷皂苷VI含量測定

2.3.1 色譜條件

檢測波長為212 nm，流動相乙腈：水(30∶70)，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，色譜柱為Agilent Eclipse C18(4.6×250 mm，5 μm)。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取川續(xù)斷皂苷VI對照品18.30 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制成每1 mL含1.830 mg的溶液，搖勻，即得[1]。

2.3.3 供試品溶液制備

精密稱取續(xù)斷細粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得[1]。

2.3.4 線性關(guān)系的考察

配制濃度為0.1830 mg/mL的川續(xù)斷皂苷VI對照品溶液，分別取8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL、20 μL的對照品。按“2.2.1”項下色譜條件測定。

2.3.5 樣品測定

精密稱取續(xù)斷細粉0.5 g，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，按“ 2.3.1” 項下色譜條件進行測定，計算，即得。

2.4 最佳工藝驗證

為驗證優(yōu)選最佳工藝的科學(xué)性、 穩(wěn)定性和可重復(fù)性，對正交試驗優(yōu)選出的最佳工藝進行工藝驗證，按最佳工藝制備樣品，平行3份，測定川續(xù)斷皂苷VI的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系

以對照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行回歸處理，得到回歸方程為Y=3.00X+0.0158(r2= 0.9998) ，表明川續(xù)斷皂苷VI的質(zhì)量在1.464～3.660 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.2 單因素分析

3.2.1 水洗量

水洗量為2倍、4倍、6倍、8倍、10倍時，川續(xù)斷皂苷VI的含量分別為7.29%、7.50%、7.58%、7.79%、5.86%，當(dāng)水洗量為8倍時，其含量最高，因此考慮水洗量以8倍水量為宜。

3.2.2 水洗時間

水洗時間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min時，川續(xù)斷皂苷VI的含量分別為7.13%、6.12%、6.27%、5.67%、6.68%，當(dāng)水洗時間為10 min時，其含量最高，因此考慮水洗時間以10 min為宜。

3.2.3 浸潤水量

浸潤水量為2倍、4倍、6倍、8倍、10倍時，川續(xù)斷皂苷VI的含量分別為6.12%、7.00%、8.43%、7.37%、5.56%，當(dāng)浸潤水量為6倍時，其含量最高，因此考慮浸潤水量以6倍水量為宜。

3.2.4 浸潤時間

浸潤時間為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h時，川續(xù)斷皂苷VI的含量分別為5.76%、5.73%、5.78%、5.80%、5.83%，含量無顯著性差異，綜合考慮加工時間以浸潤時間2 h時為宜。

3.2.5 干燥溫度

干燥溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃時，川續(xù)斷皂苷VI的含量分別為6.89%、6.91%、6.90%，含量無顯著差異，當(dāng)干燥溫度為60 ℃時，其含量最高，因此考慮干燥溫度60 ℃為宜。

3.2.6 切片厚度

切片厚度為3 mm、4 mm、5 mm時，川續(xù)斷皂苷VI的含量分別為5.97%、6.00%、5.95%，含量無顯著差異，當(dāng)切片厚度為4 mm時，其含量最高，因此考慮切片厚度4 mm為宜。

3.2.7 正交試驗結(jié)果

以川續(xù)斷皂苷VI含量為評價指標(biāo)，對表2中的結(jié)果進行極差分析，各因素的影響順序為B>C>A，因此優(yōu)選出最佳工藝為A2B2C1，由表3中各因素進行方差分析表明，各因素對試驗結(jié)果均無顯著性影響，故選擇均值最大的即A2B2C1，即取生續(xù)斷除雜，加8倍量水洗10 min，加5倍量水浸潤2 h，切制成4 mm厚片在60 ℃下干燥。

3.2.8 最佳工藝驗證

根據(jù)優(yōu)選出的最佳工藝制備樣品，平行3份，進行驗證性試驗，結(jié)果得到平均含量為5.78%，RSD為2.66%，說明工藝驗證所得結(jié)果差異較小，證明選出的最佳工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗結(jié)果與直觀分析Tab.2 Orthogonal test results and direct analysis

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

以水洗量、水洗時間、浸潤水量為考察因素進行正交試驗設(shè)計，以川續(xù)斷皂苷VI含量為評價指標(biāo)，對續(xù)斷生品炮制工藝進行正交優(yōu)選，得出續(xù)斷最佳工藝為：取續(xù)斷藥材，除雜，用8倍量水洗10 min，5倍水浸潤2 h，切制成4 mm厚片，在60 ℃干燥溫度下烘干。經(jīng)最佳工藝驗證，證明選出的續(xù)斷生品炮制工藝穩(wěn)定可行，可為續(xù)斷生產(chǎn)提供參考。

4.2 討論

本研究以生續(xù)斷炮制過程中的水洗量、水洗時間、浸潤水量、浸潤時間、切制厚度、干燥溫度6個單因素考察，以川續(xù)斷皂苷VI的含量為指標(biāo)，對續(xù)斷的炮制工藝進行優(yōu)選。根據(jù)結(jié)果分析，得到水洗量、水洗時間、浸潤水量具有顯著性差異。但是在做正交實驗得出結(jié)果，卻無顯著性差異，且含量有所降低，可能是在炮制過程中，各道工序?qū)χ笜?biāo)成分有綜合影響，從而含量有所降低，這可能就是同種藥材，經(jīng)過炮制加工后，生品與炮制品藥效不同，是炮制理論中“生熟異治”的體現(xiàn)，且不同炮制品藥效強弱亦不同，不過這還有待進一步的通過藥理試驗來證明。