鄧代艷，楊詩(shī)雯，黨笑笑，王 歡，張勇民，董登祥

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550018； 3法國(guó)索邦大學(xué) 法國(guó)國(guó)家科研中心，巴黎 75005)

齊墩果酸(oleanlicacid，OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，以游離形式或糖苷的形式存在于種植物中，女貞果實(shí)、梔子果實(shí)及夏枯草等均有存在[1-2]。齊墩果酸具有保護(hù)肝臟、降低血糖、抗衰老和抗癌等豐富的藥理作用[3-5]。目前齊墩果酸在臨床上主要作為口服制劑使用，用于治療急慢性肝炎的輔助治療，在臨床上已經(jīng)用作抗癌輔助藥物使用。研究表明，C-28位羧基成酯或酰胺的齊墩果酸衍生物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[6-7]。Hamed等發(fā)現(xiàn)了一種沙漠植物，并從此植物中成功分離得到含N-乙酰氨基葡萄糖支鏈的天然齊墩果酸型皂苷衍生物，進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)研究可知此化合物對(duì)小鼠纖維肉瘤細(xì)胞株有顯著的抑制作用[8-9]。天然產(chǎn)物通過(guò)糖基化反應(yīng)后形成的糖苷類化合物，提高天然產(chǎn)物的穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度，因而受到越來(lái)越多的關(guān)注[10-11]。且已有大量研究表明，糖鏈對(duì)三萜類化合物的生物活性關(guān)系密切，糖鏈的改變可能對(duì)皂苷的活性產(chǎn)生較大影響。王歡等[12]通過(guò)糖苷化對(duì)常春藤進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，得到的糖苷衍生物顯著的提高了常春藤的水溶性，同時(shí)增強(qiáng)了體外抗膀胱癌細(xì)胞的活性。

齊墩果酸雖然具有較多的藥理活性，但因其水溶性較差、口服無(wú)效、生物利用度低等缺點(diǎn)從而限制了其臨床應(yīng)用[13]。本文以葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖為起始原料，對(duì)糖上羥基進(jìn)行保護(hù)與去保護(hù)，得到一系列的糖片段，利用合成的糖片段對(duì)齊墩果酸的碳3位羥基進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，獲得3個(gè)糖苷化衍生物。新化合物都經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行驗(yàn)證。采用MTT法，選用高表達(dá)人結(jié)腸癌細(xì)胞(HTC8)對(duì)3～5進(jìn)行初步的體外抗腫瘤活性研究。本研究為今后齊墩果酸及其衍生藥物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了依據(jù)。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.1 Synthetic routes of target compounds

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

INOVA-400與INOVA-500核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；FINNIGANLACQ-DECA質(zhì)譜儀，Heidolph- 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DF-II集熱式磁力攪拌器；2ZX-025旋片真空泵； WFH-203B三用紫外分析儀。

D-半乳糖、D-葡萄糖D-氨基葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸對(duì)照品，純度≥99%，南京源植生物科技有限公司；齊墩果酸-28-羧甲酯[10]；對(duì)甲基-苯基-S-2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-D-吡喃葡萄糖苷，2，3，4，6-四-O-乙酰基 1-O-D-吡喃半乳糖三氯乙酰亞胺酸酯，3，4，6-三-O-乙?；?2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基 -D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯，實(shí)驗(yàn)室自制；吡啶，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;溴化芐，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純。體外抗HCT8活性租借科研樓實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞室進(jìn)行細(xì)胞篩選完成。

1.2 合成 (圖1)

1.2.1 3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-齊墩果酸-28-羧甲酯(3)的合成

稱量100 mg化合物a(0.2 mmol)和210 mg(0.42 mmol)化合物2置于干燥的50 mL反應(yīng)瓶中，N-碘代丁二酰亞胺( NIS) 90 mg(0.36 mmol)和分子篩80 mg，抽真空，N2保護(hù)下加入無(wú)水 DCM 1.5 mL使底物溶解；將反應(yīng)瓶置入冰水混合浴中平衡15 min后，加入TfOH 5 μL ( 0.05 mmol)，反應(yīng)體系一直保持在冰水浴中，跟蹤點(diǎn)板，待反應(yīng)完全(10%H2SO4-C2H5OH溶液作為顯色劑，Cy/EtOAc=2∶1作為展開(kāi)劑，Rf=0.55)。等待反應(yīng)完全后量取飽和NaHCO3加入反應(yīng)瓶調(diào)pH=7，用DCM萃取反應(yīng)體系，收集DCM層，將濾液用無(wú)水的固體粉末狀硫酸鎂干燥過(guò)濾濃縮得待過(guò)柱產(chǎn)物，將待過(guò)物至于硅膠柱中，用Cy/EtOAc =5∶1作為洗脫劑，過(guò)柱、濃縮得110 mg化合物 b，產(chǎn)率為46.7%。

稱量50 mg化合物b置于干燥的50 mL反應(yīng)瓶中，加入攪拌子，量取約5 mL甲醇溶液使其完全溶解；另稱量100 mg金屬鈉，剪碎緩慢加入50 mL無(wú)水甲醇溶液中，制備新的甲醇鈉溶液，量取新制的甲醇鈉溶液少量多次加入反應(yīng)瓶中，維持反應(yīng)體系為強(qiáng)堿性，室溫自然環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，跟蹤點(diǎn)板，待反應(yīng)完全 (10%H2SO4-C2H5OH 溶液為顯色劑，Cy/EtOAc=1∶3 作為展開(kāi)劑，Rf=0.22)。 加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂調(diào) pH=7，過(guò)濾，濃縮得待過(guò)產(chǎn)物，用HL-20凝膠柱純化待過(guò)產(chǎn)物，以甲醇為洗脫劑，濃縮得29mg化合物3，產(chǎn)率為79.6%。

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ5.15(d，J=122.0 Hz，1H)，4.64(s，2H)，3.65(d，J=4.5 Hz，2H)，3.55(d，J=35.8 Hz，2H)，3.36(s，6H)，3.27-3.13(m，1H)，2.08-1.96(m，1H)，1.90(s，1H)，1.79-1.67(m，7H)，1.28(s，9H)，1.14(t，J=10.8 Hz，4H)，0.93(ddd，J=18.3，17.7，7.5 Hz，13H)，0.82-0.68(m，4H)；MS(ESI)m/z：{[M+Na]+}655.3。

1.2.2 3-O-β-D-吡喃半乳糖基-齊墩果酸-28-羧甲酯(4)的合成

稱量100 mg化合物c(0.04 mmol)和100 mg(0.2 mmol)化合物2置于干燥的50 mL反應(yīng)瓶中，加入攪拌子與適量分子篩，以N2注入保護(hù)反應(yīng)瓶，加入1.5 mL 無(wú)水二氯甲烷使底物完全溶解，將反應(yīng)瓶置入冰水混合浴中平衡15 min后，加入5 μLTMSOTf，反應(yīng)體系一直保持在冰水浴中，跟蹤點(diǎn)板，待反應(yīng)完全(10%H2SO4-C2H5OH溶液為顯色劑，Cy/EtOAc=2∶1作為展開(kāi)劑，Rf=0.55)。 反應(yīng)完全后量取飽和NaHCO3加入反應(yīng)瓶調(diào)pH=7，用二氯甲烷萃取反應(yīng)體系，收集二氯甲烷層，將濾液用無(wú)水的固體粉末狀硫酸鎂干燥過(guò)濾濃縮得待過(guò)柱產(chǎn)物，將待過(guò)物至于硅膠柱中，用Cy/EtOAc=5∶1 作為洗脫劑，過(guò)柱、濃縮得95 mg化合物 d，產(chǎn)率為 50.7%。

稱量25 mg化合物d置于干燥的50 mL反應(yīng)瓶中，加入攪拌子，量取約5 mL甲醇溶液使其完全溶解；另稱量100 mg金屬鈉，剪碎緩慢加入50 mL無(wú)水甲醇溶液中，制備新的甲醇鈉溶液，量取新制的甲醇鈉溶液少量多次向反應(yīng)瓶中，維持反應(yīng)體系為堿性，室溫自然環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，跟蹤點(diǎn)板，待反應(yīng)完全(10%H2SO4-C2H5OH溶液為顯色劑，Cy/EtOAc=1∶3作為展開(kāi)劑，Rf=0.25)。加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂調(diào)pH=7，過(guò)濾，濃縮得待過(guò)產(chǎn)物，用HL-20凝膠柱純化待過(guò)產(chǎn)物，用甲醇洗脫劑，濃縮得29 mg化合物4，產(chǎn)率為69.8%。

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ5.05(s，2H)，4.25(s，2H)，3.80-3.68(m，3H)，3.00(d，J=103.2 Hz，1H)，2.39(s，1H)，1.92(s，2H)，1.60(s，5H)，1.25(s，9H)，1.12(d，J=8.7 Hz，3H)，0.98-0.84(m，11H)；MS(ESI)m/z：{[M+Na]+}655.3。

1.2.3 3-O-(2-去氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-齊墩果酸-28-羧甲酯5的合成

稱量200 mg化合物e(0.2 mmol)和100 mg(0.2 mmol)化合物2置于干燥的50 mL反應(yīng)瓶中，加入攪拌子與適量分子篩，以N2注入保護(hù)反應(yīng)瓶，加入1.5 mL無(wú)水二氯甲烷使底物完全溶解，將反應(yīng)瓶置入冰水混合浴中平衡15 min后，平衡15 min后加入5μL的TMSOTf，反應(yīng)體系一直保持在冰水浴中，跟蹤點(diǎn)板，待反應(yīng)完全(10%H2SO4-C2H5OH溶液為顯色劑，Cy/EtOAc=2∶1作為展開(kāi)劑，Rf=0.55)。反應(yīng)完全后量取飽和NaHCO3加入反應(yīng)瓶調(diào)pH=7，用二氯甲烷萃取反應(yīng)體系，收集二氯甲烷層，將濾液用無(wú)水的固體粉末狀硫酸鎂干燥過(guò)濾濃縮得待過(guò)柱產(chǎn)物，將待過(guò)物至于硅膠柱中，用Cy/EtOAc=5∶1作為洗脫劑，過(guò)柱、濃縮得88 mg化合物f，產(chǎn)率為47.1%。

稱量50 mg化合物f于50 mL置于干燥的50 mL反應(yīng)瓶中，加入攪拌子，量取2 mL 85%NH2-NH2·H2O和3 mL95%EtOH溶液加入此反應(yīng)中，80 ℃反應(yīng)5 h跟蹤點(diǎn)板待反應(yīng)完全(10%H2SO4-C2H5OH溶液為顯色劑，DCM/MeOH=8∶1，Rf=0.53)。加入適量稀HCl調(diào)pH值至中性，除去溶劑以后用甲醇溶解，過(guò)濾濃縮得待過(guò)產(chǎn)物。量取約5 mL甲醇溶液使其完全溶解；另稱量100 mg金屬鈉，剪碎緩慢加入50 mL無(wú)水甲醇溶液中，制備新的甲醇鈉溶液，量取新制的甲醇鈉溶液少量多次加入反應(yīng)瓶中，維持反應(yīng)體系為強(qiáng)堿性，室溫自然環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，跟蹤點(diǎn)板，待反應(yīng)完全(10%H2SO4-C2H5OH溶液為顯色劑，Cy/EtOAc=1∶3作為展開(kāi)劑，Rf=0.08)。加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂調(diào)pH=7，過(guò)濾，濃縮得待過(guò)產(chǎn)物，將得到的白色固體，用HL-20凝膠柱純化粗產(chǎn)物，洗脫劑為甲醇，濃縮得17.5 mg化合物5，產(chǎn)率為75.4%。

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ5.30(s，1H)，4.84(s，1H)，4.68(s，1H)，4.01-3.83(m，5H)，3.26(d，J=60.4 Hz，2H)，2.34(d，J=14.0 Hz，1H)，2.01(d，J=13.7 Hz，1H)，1.62(d，J=22.1 Hz，5H)，1.23(d，J=13.6 Hz，7H)，1.14(s，3H)，0.90(t，J=39.0 Hz，13H)；MS(ESI)m/z：{[M+H]+}632.2。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)合成

以齊墩果酸苷元為起始原料，對(duì)其28-COOH和3-OH進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，合成了3種齊墩果酸糖苷衍生物。目標(biāo)產(chǎn)物在反應(yīng)過(guò)程中采用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，柱層析純化，其結(jié)構(gòu)通過(guò)1HNMR，13CNMR，MS得以確證。

在合成反應(yīng)時(shí)，催化劑的選擇與用量對(duì)反應(yīng)影響較大。由于TfOH是高效的H+催化劑，用量過(guò)多容易引起糖片段的碳正離子大量生成，生成的正離子無(wú)法與苷元上的羥基作用，就會(huì)掉落，反應(yīng)很難發(fā)生，因此合成苷元的糖苷衍生物反應(yīng)中，必須控制TfOH的用量。NIS-TfOH是糖基化反應(yīng)中常用的類鹵鎓離子親電劑，但由于其催化劑活性強(qiáng)，一般反應(yīng)體系應(yīng)在0 ℃甚至更低的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于活化硫苷親電試劑的反應(yīng)，主要使用NBS和NIS，加入適量的質(zhì)子酸可顯著提高反應(yīng)的速率。溫度對(duì)此反應(yīng)的影響極為重要，在單糖片段與苷元合成衍生物的過(guò)程中，使用少量稀釋的TfOH能有效的保證反應(yīng)的順利進(jìn)行。

2.2 細(xì)胞活性

以阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照藥，采用MTT法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行初步的體外活性測(cè)試，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)HCT8的體外抑制率Tab.1 Inhibitory rate of target compounds on HCT8 in vitro

由表1可見(jiàn)，齊墩果酸經(jīng)C-28位甲酯化和C-3位連接單糖后得到的衍生物(3～5)在4不同濃度下對(duì)HCT8均具有抑制作用。其中，濃度為1×10-3mol·L-1時(shí)，3種化合物對(duì)HCT8的抑制活性較其他的濃度時(shí)要高，且目標(biāo)化合物3和5比4和阿霉素對(duì)照品的抑制作用更加明顯。以上結(jié)果均為體外試驗(yàn)結(jié)果，還有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)活性研究。

3 結(jié)論

合成了3種齊墩果酸糖苷衍生物并研究了其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制活性。為今后齊墩果酸及其衍生藥物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了依據(jù)，為其進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。對(duì)于天然化合物中具有良好活性的化合物，但水溶性差的物質(zhì)，可考慮用糖片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修飾，可顯著改善其水溶性差的難題。另一方面，可豐富天然化合物的糖苷種類，增加苷元的糖苷數(shù)據(jù)庫(kù)，為進(jìn)一步研究苷元與其糖苷直接的關(guān)聯(lián)提供了依據(jù)。