王素星,杜夢(mèng)穎,張華星,魏金剛,邵偉華,呂彩霞,姚麗霞*

(1河北省人民醫(yī)院老年病二科,石家莊 050051;2河北省人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)處;3石家莊市第五醫(yī)院外科;*通訊作者,E-mail:83312832@qq.com)

追趕生長是機(jī)體在營養(yǎng)、疾病等不利因素影響下出現(xiàn)生長受抑,并在相關(guān)因素解除后出現(xiàn)的快速生長現(xiàn)象,可出現(xiàn)在胎兒期、嬰幼兒期、青少年期和成年期[1]。已有相關(guān)研究多關(guān)注宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型(IUGR)[2,3],實(shí)際上成年期追趕生長現(xiàn)象更為常見[4],但對(duì)其研究并不深入,亦未引起足夠重視。追趕生長的本質(zhì)為能量攝入的波動(dòng),機(jī)體能量攝入的改變可被外周及中樞攝食信號(hào)傳輸至下丘腦,后者精細(xì)地調(diào)控能量代謝[5]。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)作為下丘腦刺激食欲的主要神經(jīng)遞質(zhì)[6],與攝食密切相關(guān),廣泛分布于哺乳動(dòng)物各器官,通過與靶器官上不同受體特異性結(jié)合參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種重要的生理活動(dòng),尤其對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)作用較為顯著[7]。其中,NPY與NPY1、NPY2受體在骨代謝中發(fā)揮重要作用。NPY2受體主要在中樞調(diào)節(jié)骨代謝,NPY過表達(dá)可明顯抑制骨形成,同時(shí)NPY-/-小鼠骨生成的面積和速度明顯增加[8]。NPY1受體主要存在于外周骨組織,NPY與外周成骨細(xì)胞特異性NPY1受體結(jié)合后抑制成骨細(xì)胞活性和骨生成,成骨細(xì)胞NPY1受體缺失可使股骨松質(zhì)骨體積、小梁厚度和小梁數(shù)目顯著增加,成骨細(xì)胞活性增強(qiáng),同時(shí)皮質(zhì)骨和骨膜表面的礦物質(zhì)沉積率增加,股骨直徑增加[9]。亦有研究顯示,NPY通過中樞和外周神經(jīng)組織中的NPY2受體抑制去甲腎上腺素和皮質(zhì)酮的產(chǎn)生或釋放,從而減少骨骼在慢性應(yīng)激期間的丟失[10]。

白藜蘆醇是一種存在于紅酒中的多酚,多項(xiàng)研究已證實(shí)白藜蘆醇與骨代謝密切相關(guān)[11,12]。白藜蘆醇可提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶和脯氨酰羥化酶活性,增加成骨細(xì)胞的DNA合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[11];亦可激活成骨轉(zhuǎn)錄因子CBFA-1,增強(qiáng)骨特異性Ⅰ型膠原的轉(zhuǎn)錄,刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化,并激活沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator 1,Sirt-1)使骨組織細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化和成骨[12]。白藜蘆醇是骨骼保護(hù)劑,NPY亦與骨代謝密切相關(guān),在成年期追趕生長,能量的波動(dòng)使NPY發(fā)生怎樣的變化,白藜蘆醇對(duì)NPY有何影響,目前尚無報(bào)道。本研究以成年期追趕生長大鼠為研究對(duì)象,觀察白藜蘆醇對(duì)股骨NPY蛋白和NPY mRNA表達(dá)的影響,探討白藜蘆醇對(duì)成年期追趕生長大鼠骨密度影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

白藜蘆醇,粉劑,純度99%(Sigma,St Louis,MO,USA)。兔抗大鼠NPY抗體(Abcam Company,USA),山羊抗兔IgG(H+L,HRP);RT-PCR試劑盒和實(shí)時(shí)定量試劑盒購于大連TaKaRa公司;核糖核酸提取試劑盒(Triozol Reagent,Invitrogen Life technologies,USA),血清NPY測(cè)定ELISA試劑盒(Elabscience,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雄性SD大鼠60只,SPF級(jí),體質(zhì)量160 g±20 g,購自河北醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 動(dòng)物分組與處理

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)分為6組,每組10只:4周組3組(正常飲食4周組、熱卡限制4周組,熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組)和12周組3組(正常飲食12周組、追趕生長組、追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組)。分別在實(shí)驗(yàn)第4和12周末進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析僅限于相同時(shí)間點(diǎn)組別之間進(jìn)行。追趕生長組模型的制作參閱課題組以前模式:前4周給予正常飲食組相同體質(zhì)量大鼠進(jìn)食量60%的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料,然后給予正常飲食組相同體質(zhì)量大鼠進(jìn)食量等量的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料8周[1,4]。熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組為限制飲食同時(shí)予以白藜蘆醇治療4周;追趕生長組為限制飲食4周+正常飲食8周;追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組為限制飲食4周+正常飲食同時(shí)白藜蘆醇干預(yù)8周。標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。正常飲食4/12周組自由進(jìn)食,熱卡限制4周組給予正常飲食組相同體質(zhì)量大鼠進(jìn)食量60%的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料。白藜蘆醇用生理鹽水配制成濃度15 mg/ml的懸濁液,根據(jù)體質(zhì)量每天灌胃給予白藜蘆醇(100 mg/kg)干預(yù)[1],熱卡限制4周組和追趕生長組灌胃給與同體積生理鹽水。

1.4 骨密度檢測(cè)

分別在實(shí)驗(yàn)的第4和12周末,大鼠禁食過夜,精確稱量體質(zhì)量,腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉,待大鼠肌力消失,呼吸平穩(wěn),仰臥位將四肢用膠帶固定于硬紙板,用美國GE Lunar公司生產(chǎn)的DEXA儀從鼻尖掃描至尾端,行全身及多部位BMD測(cè)定[13]。所得數(shù)據(jù)左右大腿合計(jì)為大腿部,除頭部外合計(jì)為全身。

1.5 Western blot測(cè)定骨骼NPY蛋白表達(dá)

取股骨,剝離肌肉和結(jié)締組織,將骨組織在液氮中研磨成粉,參照文獻(xiàn)[14]方法提取并定量組織蛋白。取40 μg蛋白樣品行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別用NPY、β-actin 4 ℃孵育過夜;次日洗膜、二抗孵育1 h、顯影并分析。

1.6 RT-PCR測(cè)定骨骼NPY mRNA

Trizol法提取大鼠股骨頭總RNA,分光光度計(jì)檢測(cè)提取樣品260 nm、280 nm的吸光值。計(jì)算OD260/OD280(R值),檢測(cè)RNA純度。按SYBRRR PrimeScripTMRT-PCR Kit說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和quantitative real-time PCR擴(kuò)增。RT-PCR數(shù)據(jù)收集由系統(tǒng)自帶軟件完成,通過軟件計(jì)算所有樣品的Ct值,以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)。采用2-ΔΔCt方法對(duì)目標(biāo)基因NPY mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。NPY引物:上游5′-TAGGTAACAAACGAATGGG GCTGTG-3′,下游5′-CGCGTCCTCGCCCG GATTGTC-3′,GAPDH引物:上游5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′,下游5′-CCACCCTGTTG CTGTAGCCATA-3′。

1.7 血清NPY濃度測(cè)定

用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清NPY濃度,按照試劑盒說明書操作,在450 nm波長下測(cè)光密度值(OD值),計(jì)算血清NPY含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,以單因素方差分析比較組間差異,各均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度變化

熱卡限制后,與正常飲食4周組相比,熱卡限制4周組全身及大腿骨密度下降明顯(P<0.05)?；謴?fù)飲食后,追趕生長組全身及大腿骨密度與正常飲食12周組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與追趕生長組相比,追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組全身及大腿骨密度顯著升高(P<0.05);與熱卡限制組相比,熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組全身及大腿骨密度呈下降趨勢(shì)(P<0.05,見圖1)。

與正常飲食4周組相比，*P<0.05，**P<0.01；與熱卡限制4周組相比，#P<0.05；與正常飲食12周組相比，△P<0.05；與追趕生長組相比，&P<0.05

2.2 骨骼NPY Western blot結(jié)果

與正常飲食4周組比較,熱卡限制4周組股骨NPY的表達(dá)明顯增加(P<0.01),重飼后,追趕生長組NPY表達(dá)有所下降,但至實(shí)驗(yàn)結(jié)束仍明顯高于正常飲食12周組(P<0.01);熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組股骨NPY輕度下降,與熱卡限制4周組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,仍顯著高于正常飲食4周組(P<0.01),追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組股骨NPY表達(dá)較追趕生長組顯著減少(P<0.01),與正常飲食12周組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。

1.正常飲食4周組;2.熱卡限制4周組;3.熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組;4.正常飲食12周組;5.追趕生長組;6.追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組;與正常飲食4周組相比，**P<0.01;與正常飲食12周組相比,##P<0.01;與追趕生長組相比,&&P<0.01

2.3 骨骼NPY RT-PCR結(jié)果

由2-ΔΔCt可知,與正常飲食4周組比較,熱卡限制4周組骨組織中NPY mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);開放飲食8周后,追趕生長組股骨組織中NPY mRNA表達(dá)有所下降,但仍顯著高于正常飲食12周組(P<0.01)。與熱卡限制4周組相比,熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組骨組織NPY mRNA 表達(dá)輕度下降(P>0.05),但仍顯著高于正常飲食4周組(P<0.01);追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組骨組織NPY mRNA表達(dá)較追趕生長組顯著減少(P<0.01),達(dá)到正常飲食12周組水平(P>0.05,見圖3)。

與正常飲食4周組相比，**P<0.01；與正常飲食12周組相比，##P<0.01；與追趕生長組相比，&&P<0.01

2.4 血清NPY水平比較

熱卡限制4周組血清NPY明顯升高,與正常飲食4周組相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),追趕生長組血清NPY水平顯著高于正常飲食12周組(P<0.01)。與追趕生長組相比,追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組血清NPY水平下降明顯(P<0.01),達(dá)到正常飲食12周組水平(P>0.05),熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組NPY水平較熱卡限制4周組明顯下降(P<0.01),但仍較正常飲食4周組高(P<0.05,見圖4)。

與正常飲食4周組相比，*P<0.05，**P<0.01；與熱卡限制4周組相比，##P<0.01；與正常飲食12周組相比,##P<0.01；與追趕生長組相比，&&P<0.01

3 討論

限食后重飼導(dǎo)致的追趕生長是短期內(nèi)能量攝入的改變,NPY是對(duì)能量攝入及食欲最為敏感的神經(jīng)遞質(zhì)[6]。NPY不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,也存在于外周骨組織、脂肪組織、血管、腎臟組織等,參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種重要的生理活動(dòng),尤其對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)作用較為顯著[7]。本研究結(jié)果顯示,NPY在成年期追趕生長大鼠模型中,熱卡限制4周末骨骼NPY表達(dá)顯著增高,恢復(fù)飲食后有輕度降低,但至實(shí)驗(yàn)結(jié)束仍顯著高于正常飲食組。同時(shí),本研究亦顯示,熱卡限制可導(dǎo)致骨密度顯著下降,恢復(fù)能量供應(yīng)后的追趕生長可顯著提升骨密度。既往諸多研究發(fā)現(xiàn)NPY與骨代謝密切相關(guān)。神經(jīng)肽Y水平與成骨細(xì)胞活性呈負(fù)相關(guān),神經(jīng)肽Y缺失的小鼠顯示出骨量和成骨細(xì)胞活性的增加,而下丘腦過表達(dá)神經(jīng)肽Y可引起骨量的顯著減少[8]。經(jīng)NPY特異性受體拮抗劑治療后骨質(zhì)疏松小鼠骨礦化增強(qiáng),骨丟失減少,骨密度增加[9,15]。在本研究中限食期間NPY的表達(dá)與骨密度呈相反的變化趨勢(shì),推測(cè)熱卡限制導(dǎo)致骨骼中NPY表達(dá)增加進(jìn)而抑制了成骨細(xì)胞的活性,導(dǎo)致骨生成減少,骨密度降低。同時(shí)在限食期間,大鼠體質(zhì)量減輕,骨骼承受的機(jī)械力減小,NPY表達(dá)的增加負(fù)性調(diào)控骨生成,減少機(jī)體在骨骼生成代謝方面的能量消耗,以保障重要器官的能量供給。因此,NPY在追趕生長過程中的熱卡限制階段調(diào)節(jié)了骨穩(wěn)態(tài)。

白黎蘆醇是一種具有強(qiáng)生物活性的天然多酚類物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用。目前研究已證實(shí),白藜蘆醇與骨代謝密切相關(guān),有抗骨質(zhì)疏松作用[11,12]。本研究顯示,白藜蘆醇對(duì)恢復(fù)飲食后的追趕生長期的大鼠骨密度有提升作用,同時(shí)顯著降低了NPY在骨組織的表達(dá)。雖然白藜蘆醇與NPY均已被證實(shí)與骨代謝關(guān)系密切,但目前國內(nèi)關(guān)于白藜蘆醇對(duì)NPY影響的研究較少。國外研究目前主要集中在白藜蘆醇對(duì)下丘腦NPY的影響,并且研究結(jié)果存在爭議。其中一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可使高脂飲食的小鼠下丘腦弓狀核生成NPY減少,進(jìn)而影響脂肪生成,降低體質(zhì)量[16]。白藜蘆醇通過過表達(dá)厭食肽(前阿片蛋白)和抑制食欲肽(神經(jīng)肽Y)恢復(fù)神經(jīng)元中的瘦素信號(hào),從而減少食物攝入[17]。也有研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能顯著提高前額葉皮層神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和5-羥色胺水平,增加腦內(nèi)NPY的表達(dá),對(duì)抑郁癥有拮抗作用[18]。本研究中白藜蘆醇對(duì)骨骼NPY的表達(dá)及血清NPY水平均有明顯抑制作用。多項(xiàng)研究已證實(shí)NPY對(duì)骨生成存在顯著的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[8,9,15],白藜蘆醇通過抑制骨骼NPY的表達(dá),促進(jìn)骨生成。另外,白藜蘆醇是SIRT1的強(qiáng)力激活劑,有研究顯示,在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠模型上,沉默NPY的表達(dá)可激活SIRT1信號(hào)通路,從而改善骨骼損傷[19]。外源注射煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可部分通過激活SITR1的表達(dá)進(jìn)而抑制NPY的轉(zhuǎn)錄活性[20]。以上研究結(jié)果可得出,SIRT1與NPY的表達(dá)存在負(fù)性調(diào)控作用,一方表達(dá)的增強(qiáng)會(huì)抑制另一方的表達(dá)。本研究中,白藜蘆醇亦可通過激活SIRT1抑制NPY的表達(dá),進(jìn)而提升骨密度。

需要注意的是,本研究結(jié)果顯示白藜蘆醇在機(jī)體不同能量供應(yīng)狀態(tài)下對(duì)NPY的影響程度不同。熱卡限制期間,白藜蘆醇使骨骼NPY的表達(dá)輕度下降,與未干預(yù)前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重飼后,白藜蘆醇可使骨骼NPY表達(dá)顯著下降,恢復(fù)至正常對(duì)照水平。與此同步的是,白藜蘆醇僅在追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組對(duì)骨密度有提升作用,在熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組對(duì)骨密度影響不明顯。研究顯示食物缺乏可使成骨細(xì)胞活性受抑[21]，本研究中減少40%的食物攝入使得骨形成所需的基本原料明顯減少，成骨細(xì)胞活性受抑，能量分配首先確保機(jī)體的關(guān)鍵器官基本代謝活動(dòng)。在此種情況下,即使應(yīng)用骨保護(hù)劑,促進(jìn)骨形成的作用可能亦不明顯,對(duì)某些負(fù)性調(diào)控骨生成基因(如NPY)表達(dá)的抑制作用不會(huì)太顯著。一旦能量供應(yīng)恢復(fù),在追趕生長白藜蘆醇干預(yù)組,機(jī)體的饑餓應(yīng)激解除,白藜蘆醇對(duì)骨骼NPY表達(dá)的抑制作用得以呈現(xiàn),使其骨密度顯著提升。據(jù)此推論白藜蘆醇的骨骼保護(hù)作用依賴于機(jī)體能量供給。

另外，血清NPY與骨骼NPY表達(dá)在追趕生長過程中的趨勢(shì)不盡相同。熱卡限制期間，血清NPY濃度與骨骼NPY表達(dá)均呈顯著升高趨勢(shì)，但開放飲食后，骨骼NPY表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但血清NPY水平變化不明顯。因機(jī)體中下丘腦及其他器官都能分泌NPY[22]，故推測(cè)，血清NPY來源于除骨骼以外的其他器官。同時(shí),本研究中為了避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重飼時(shí)過飽,按體質(zhì)量匹配投喂的食量對(duì)于機(jī)體饑餓后的需求相對(duì)不足,故下丘腦及受控于下丘腦的靶器官可能仍繼續(xù)分泌較多的NPY。推測(cè)延長追趕時(shí)間,血清NPY水平及骨骼NPY表達(dá)應(yīng)可恢復(fù)至正常對(duì)照水平。

綜上,白藜蘆醇可能通過降低成年期追趕生長大鼠骨組織NPY的表達(dá),同時(shí)降低血清NPY濃度,進(jìn)而提升全身和局部骨密度,發(fā)揮對(duì)追趕生長大鼠的骨保護(hù)作用。但白藜蘆醇對(duì)骨骼NPY表達(dá)的抑制作用依賴于充足的營養(yǎng)供應(yīng)。在該模型中所涉及到的其他影響骨代謝的基因改變情況需要更加深入的研究。