杜陽陽，張 放，苗智穎，趙 紅，馬 迪，王 靜，李淑英，鄭春陽，李勁濤

宮頸癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)居女性惡性腫瘤的第二位，是危及全球婦女健康的嚴(yán)重疾病，據(jù)國際癌癥中心(IARC)估計(jì)，全球每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約52.8萬，死亡人數(shù)約26.6萬[1]。研究證明，人乳頭狀瘤病毒 (human papillomavirus，HPV) 中13種高危型長(zhǎng)期反復(fù)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件[2-4]；有研究表明HPV 58型在我國感染率較高[5-6]。盡管Gardasil 9 (HPV9價(jià)疫苗)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)上市，該疫苗可預(yù)防9型HPV所致某些疾病(包括HPV型16，18，31，33，45，52和58型所致宮頸癌、外陰癌、陰道癌和肛門癌，以及HPV 6或11型所致尖銳濕疣)[7-8]，然而這種疫苗只適用于沒有感染過HPV的人群，對(duì)于已經(jīng)感染上述相應(yīng)型別HPV而導(dǎo)致的病變患者沒有作用，因此，研制HPV58型治療性疫苗是非常必要的。依據(jù)上述事實(shí)和原理，本項(xiàng)研究以HPV58突變型E6E7(Mutant type E6E7，mE6E7)融合基因?yàn)榘悬c(diǎn)，用HPV58野生型E6E7(Wild type E6E7，wE6E7)融合基因片段作對(duì)照，利用對(duì)人無致病性的巨細(xì)胞病毒株(Towne株)細(xì)菌人工染色體(SW102 Towne bacterial artificial chromosome，SW102-T-BAC)為載體，構(gòu)建攜帶HPV58 mE6E7及wE6E7融合基因的重組巨細(xì)胞病毒，探討HPV58mE6E7的轉(zhuǎn)化活性，為HPV58型治療性疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 GalK質(zhì)粒(pGalK), 對(duì)人無致病性的巨細(xì)胞病毒株(Towne株)細(xì)菌人工染色體(SW102 Towne bacterial artificial chromosome，SW102-T-BAC)包含巨細(xì)胞病毒的全基因組，并帶有氯霉素抗性基因，為美國羅格斯大學(xué)，新澤西醫(yī)學(xué)院朱樺教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1HPV58 E6和E7野生型與突變型融合基因片段的合成 HPV E6和E7基因特有的Cys-x-x-Cys基序具有鋅指結(jié)構(gòu)與抑癌基因p53，Rb結(jié)合并降解抑癌基因。為消除E6，E7基因可能的惡性轉(zhuǎn)化活性，將鋅指結(jié)構(gòu)進(jìn)行突變[9-10]，構(gòu)建E6E7突變型融合基因。根據(jù)GenBank提供的基因編碼區(qū)序列， 對(duì)野生型基因序列加以改造，同時(shí)將E7與E6之間的終止子進(jìn)行改造，使其形成連續(xù)編碼序列，而形成融合基因(具體改造方法見圖1)，這樣mE6E7融合基因保證了讀碼框的正確性，既可消除E6與E7的轉(zhuǎn)化活性又能保留其抗原性。委托北京賽思萊博科技有限公司合成突變型E6E7(mE6E7)與野生型E6E7(wE6E7)融合基因。

1.2.2帶有T-ORF75左/右同源臂GalK、HPV58 wE6E7與mE6E7融合基因引物的設(shè)計(jì)及片段擴(kuò)增

1)依據(jù)GenBank提供的Towne株(FJ616285.1)基因序列，分別設(shè)計(jì)其開放讀碼框ORF75(Towne-ORF75左/右同源臂GalK，HPV58 E6E7融合基因引物(見表1)。委托北京賽思萊博科技有限公司引物合成。2)用所設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒GalK、HPV58 wE6E7及mE6E7融合基因片段為模板，分別擴(kuò)增GalK片斷、野生型及突變型融合基因wE6E7與mE6E7片段，反應(yīng)體系 (100 μL)：PCR mix包括Buffer、dNTP Mixture及Taq DNA polymerase，primers 10 μmol/L (表1 GalK Primers及HPV58 E6E7 Primers)， 和 200 ng GalK質(zhì)粒DNA。 PCR反應(yīng)循環(huán)：95 ℃/15 min； 31個(gè)循環(huán)95 ℃/30 s；55 ℃/30 s；72 ℃/1.5 min； 延伸72 ℃/10 min，4 ℃儲(chǔ)存。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并切膠純化回收。

表1 本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中所需引物名稱、序列及大小
Tab.1 the name, sequence and size of the primers required in this experiment

引物名稱序列產(chǎn)物大小/bpGalk Primers GalK ForwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaacccagcggcgcggccgcgctatgCCTGTTGAC-AATTAATCATCGGCA GalK Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg-TCAGCACT-GTCCTGCTCCTT1 400HPV58E6E7 Primers HPV58E6E7 Forwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaac-ccagcggcgcggccgcgctatgATGTTCCAGGACGCAGAGGAG HPV58E6E7 Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg TCCTTGCTG-TGCACA GCTAG861Galk Check Primers Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 550HPV58E6E7 check Primers Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 012

1.2.3將已純化的Galk片段插入Towne開放讀碼框75(T-ORF75) 將上述純化的GalK片段電轉(zhuǎn)到SW102-T-BAC感受態(tài)細(xì)胞，然后用1 mL LB培養(yǎng)液，于32 ℃振搖1 h后，離心，再用1×M9液洗滌沉淀物2次，將洗滌后的菌均勻涂布于M63配制的含有Galk的培養(yǎng)基[7]，在32 ℃培養(yǎng)3 d后長(zhǎng)出細(xì)菌克隆；挑選3個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR檢測(cè)GalK(表1 GalK Check Primers)。檢測(cè)正確克隆質(zhì)粒命名為SW102-T-ORF75-GalK-BAC。并制備其電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，負(fù)80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4HPV58E6E7融合基因代替GalK基因 取約800 ng已純化的T-ORF75左/右同源臂HPV58 wE6E7與mE6E7融合基因片段，分別電轉(zhuǎn)化到SW102-T-ORF75-GalK-BAC感受態(tài)細(xì)胞，用1 mL LB培養(yǎng)液，于32 ℃振搖4 h 30 min，離心，再用1×M9液洗滌細(xì)菌沉淀物2次，將細(xì)菌沉淀物混懸于1 mL M9洗滌液后，分別在進(jìn)行10倍及100倍稀釋后，用不同濃度的稀釋菌液涂布于脫GalK培養(yǎng)基[11]，32 ℃培養(yǎng)3 d，有克隆形成；分別選2個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR檢測(cè)(表1 HPV58E6E7 Check Primers)，正確克隆命名為SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC，SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC。

1.2.5轉(zhuǎn)染 ARPE-19細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)，待ARPE-19細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合度為60%時(shí)，用脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC與SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個(gè)復(fù)孔，剩余培養(yǎng)板中的3個(gè)孔細(xì)胞作為對(duì)照。24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換；并且每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。待細(xì)胞長(zhǎng)滿各孔后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿(直徑為10 cm)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HPV58 mE6E7與wE6E7表達(dá)狀況 待10 cm培養(yǎng)皿中細(xì)胞完全匯合后，收集各組細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增檢測(cè)所收集細(xì)胞中HPV58 mE6E7與wE6E7的表達(dá)，并將PCR產(chǎn)物測(cè)序分析。

1.2.7軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn) 底層軟瓊脂制備：配制1.5%瓊脂10 mL高壓滅菌，待其冷卻至大約50 ℃，加入2XDMEM 10 mL，混均，于24孔板的每個(gè)孔中加入0.8 mL，于室溫使其凝固。

上層瓊脂制備：將10 mL已滅菌含0.7%瓊脂冷卻至大約50 ℃，迅速加入10 mL含20%血清的2XDMEM培養(yǎng)液和穩(wěn)定表達(dá)SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC與SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC及未轉(zhuǎn)染的ARPE-19對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(濃度為3×103個(gè)/mL)，混勻，澆入底層鋪有軟瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞接種6個(gè)復(fù)孔，瓊脂凝固后將培養(yǎng)板放置在5% CO2、溫度為37 ℃及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)12 d。每天在倒置顯微鏡下觀察軟瓊脂中細(xì)胞克隆形成情況，并記錄克隆形成數(shù)量，以分裂3次增殖8個(gè)細(xì)胞作為1個(gè)克隆，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1HPV58 E6和E7野生型與突變型融合基因片段的合成 將HPV58 E6蛋白降解P53的活性部位、E7蛋白與pRB結(jié)合位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸改造后，所得片段基因序列如圖1。

圖1 HPV58 E6E7野生型與突變型融合基因突變位點(diǎn)序列Fig.1 HPV58 E6E7 fusion gene sequence of Wild-type and Mutant type

2.2GalK插入SW102-T-ORF75-BAC GalK培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，選取其中3個(gè)菌落，提取質(zhì)粒DNA，以3個(gè)菌落質(zhì)粒DNA為模板PCR擴(kuò)增，檢測(cè)到大小為 1 550 bp的PCR產(chǎn)物(圖2)，所得產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相一致，表明GalK已克隆至Towne細(xì)菌人工染色體的開放讀碼框75，將正確克隆命名為SW102-T-ORF75-GalK-BAC。

M為1kb plus DNA ladder，1為陰性對(duì)照，2-4為GalK插入SW102-T-ORF75-BAC后，所選取的GalK培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的3個(gè)克隆，以所選的3個(gè)克隆質(zhì)粒DNA為模板，PCR產(chǎn)物電泳的結(jié)果。圖2 GalK克隆到SW102-T-ORF75-BAC后PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification for detection GalK cloned to SW102-T-ORF75-BAC

2.3HPV58E6E7融合基因代替galK基因 經(jīng)過脫GalK培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分別選取2個(gè)菌落，檢測(cè)到大小為1 012 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)，所檢測(cè)到的片段與預(yù)期結(jié)果一致，證實(shí)HPV58 wE6E7與mE6E7分別克隆至SW102-T-ORF75-GalK-BAC。正確克隆命名為SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC，SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC。

M為1kb plus DNA ladder，1是陰性對(duì)照，2-3 ：HPV58-mE6E7替代GalK所選2個(gè)克隆PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果，4-5：HPV58 wE6E7替代GalK所選2個(gè)克隆PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果。圖3 HPV58 mE6E7與wE6E7插入SW102-T-ORF75-GalK-BAC替代GalK所選克隆PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification for verification galk replaced by HPV58-mE6E7與wE6E7 in SW102-T-ORF75-GalK-BAC

2.4轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 分別將 SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC與SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，培養(yǎng)10 d 后，在倒置顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的細(xì)胞生長(zhǎng)失去接觸抑制，出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象，其形態(tài)由原來長(zhǎng)梭形變?yōu)樽儓A、腫脹、胞漿顆粒增多(圖4)。

A為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞; B為轉(zhuǎn)染SW102-T-BAC至ARPE-19的細(xì)胞; C為轉(zhuǎn)染SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC至ARPE-19的細(xì)胞;D為轉(zhuǎn)染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC至ARPE-19的細(xì)胞。圖4 轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞生長(zhǎng)狀況(倒置顯微鏡下觀察結(jié)果 ×200)Fig.4 Growth of ARPE-19 cells were transfected (The results were observed under an inverted microscope ×200)

2.5轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7與T-ORF75-HPV58-wE6E7表達(dá)狀況 第20 d 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)T-ORF75-HPV58-mE6E7與T-ORF75-HPV58-wE6E7 表達(dá)狀況，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)到轉(zhuǎn)約250 bp、1 012 bp及1 012 bp PCR產(chǎn)物，分別為轉(zhuǎn)染SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的結(jié)果(圖 5)。 測(cè)序分析表明HPV58-mE6E7與HPV58-wE6E7穩(wěn)定表達(dá)于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。

M為1kb plus DNA ladder，1：將SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC轉(zhuǎn)染 ARPE-19細(xì)胞，培養(yǎng)后提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳的結(jié)果；2：將SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC 轉(zhuǎn)染 ARPE-19細(xì)胞，培養(yǎng)后提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果；3：用SW102-T-BAC轉(zhuǎn)染細(xì)胞ARPE-19，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)后提取RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳的結(jié)果，4：將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物電泳的結(jié)果；5：是陰性對(duì)照。圖5 細(xì)胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7與T-ORF75-HPV58-wE6E7逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Results of reverse transcription PCR of T-ORF75-HPV58-mE6E7 and T-ORF75-HPV58-wE6E7 in transfected cells

2.6軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn) 以分裂3次增殖8個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)克隆，培養(yǎng)至第6 d，在倒置顯微鏡下可觀察到穩(wěn)定表達(dá)T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的細(xì)胞組有克隆形成，而穩(wěn)定表達(dá)T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、T-BAC及未轉(zhuǎn)染的ARPE-19細(xì)胞未見克隆形成；培養(yǎng)至12 d，克隆明顯增多增大，細(xì)胞呈堆積生長(zhǎng)(圖6)，克隆形成率為23.5%(47/200)。穩(wěn)定表達(dá)T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、 T-BAC、及未轉(zhuǎn)染的ARPE-19細(xì)胞組未見有克隆形成。

圖6 轉(zhuǎn)染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7的ARPE-19細(xì)胞在軟瓊脂中形成的典型克隆(×200)Fig.6 Clone of ARPE-19 cells were transfected with SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7 in soft AGAR(×200)

3 討 論

雖然世界范圍內(nèi)已有HPV預(yù)防性疫苗上市[8,12]，預(yù)防HPV疫苗可保護(hù)健康人群免患相應(yīng)型別HPV感染所導(dǎo)致的疾病，但對(duì)已感染相應(yīng)HPV型別患病的人群沒有治療的效果，對(duì)已感染各型別HPV導(dǎo)致的各類疾病，還需相應(yīng)的治療性疫苗。目前治療性HPV疫苗還處于研發(fā)階段，理想治療性HPV疫苗既要在患者體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)的細(xì)胞免疫，又要清除患者體內(nèi)已感染的HPV，同時(shí)還要在患者體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體，中和患者體內(nèi)病毒，而抑制病毒的傳播。

高危型HPV感染的惡性腫瘤中，E7與E6蛋白是形成HPV相關(guān)惡性腫瘤及維持其惡性表型所必需的蛋白；E6通過降解P53，降低細(xì)胞對(duì)DNA合成修復(fù)能力，容易出現(xiàn)錯(cuò)誤的基因結(jié)構(gòu)；E7與pRb基因結(jié)合，誘導(dǎo)中心體合成異常增多，使得有絲分裂異常紊亂，非整倍體細(xì)胞出現(xiàn)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[13-14]。E6和E7兩個(gè)癌基因在HPV陽性惡性腫瘤細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)，因此，E6和E7蛋白屬于腫瘤細(xì)胞中特異性的病毒抗原，是HPV陽性腫瘤免疫治療的理想靶抗原，可將HPV E6和E7基因加以改造研制成治療性疫苗；但如果用野生型E7與E6基因直接作抗原，構(gòu)建E6E7融合基因，有潛在致癌性；因此，需將野生型E7基因與pRB基因結(jié)合位點(diǎn)加以改造，E6降解P53基因位點(diǎn)加以改造，使其發(fā)生突變，敲除E7與E6基因的轉(zhuǎn)化活性，并將E7與E6各自的終止密碼子加以改造，這樣所構(gòu)建的突變型融合基因，既保留了其抗原性，又去除了其致癌性，同時(shí)，也保證了融合基因讀碼框的正確性。因此，本項(xiàng)研究將E6基因結(jié)合p53、E7結(jié)合Rb活性部位鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)一些氨基酸序列加以改變，消除E6結(jié)合p53、E7結(jié)合Rb基因的降解活性，即E6第50位的亮氨酸在高危HPV中高度保守，可能在E6轉(zhuǎn)化過程中起重要作用；第63位和第106位的半胱氨酸位于E6的一對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)的兩側(cè)，在對(duì)p53的結(jié)合中起重要作用。E7中第24位半胱氨酸和第26位谷氨酸位于一對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)的兩側(cè)，第92位半胱氨酸位于一個(gè)獨(dú)立的鋅指結(jié)構(gòu)中[10]，因此，我們將這些部位堿基序列加以改變，消除E6終止密碼子，并保證E6與E7讀碼框的正確性，使其形成融合基因，分別構(gòu)建了HPV58mE6E7和HPV58wE6E7融合基因的重組病毒。通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)所構(gòu)建的重組病毒T-ORF75-HPV58-mE6E7已消除致癌活性。

利用Towne細(xì)菌人工染色體為載體，通過同源重組，已成功將HPV58E6E7融合基因連接到Towne的ORF75；Towne的ORF75編碼包膜糖蛋白gH，具有免疫原性，在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。今后將進(jìn)一步探討重組病毒T-ORF75-HPV58-mE6E7的免疫原性、免疫反應(yīng)性及其作為治療性疫苗的免疫效果。

本項(xiàng)研究采用巨細(xì)胞病毒減毒活疫苗Towne株[15-16]細(xì)菌人工人色體為載體，構(gòu)建表達(dá)HPV58E6E7去除其轉(zhuǎn)化活性融合蛋白的重組巨細(xì)胞病毒，并轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，結(jié)果顯示已成功構(gòu)建了攜帶Towne-ORF75-HPV58 mE6E7與wE6E7基因的重組病毒，為HPV58型治療性疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無