虞秀鋒，王啟源，姬文蘭，王亞梅

結核病(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染所引起的人獸共患的慢性呼吸道傳染疾病。只有深入的了解MTB感染與機體免疫細胞之間的作用機制及相關分子基礎，才能更好地預防和控制結核病。MTB作為一種典型的胞內寄生菌，機體被感染后會啟動免疫應答，防御MTB的感染，而巨噬細胞在這個過程中發(fā)揮重要作用，是宿主抵御MTB感染的第一道防線，被激活后可通過多種機制有效清除胞內的MTB。目前已證實巨噬細胞是MTB的關鍵靶細胞和宿主細胞，同時也是抗MTB的主要效應細胞，在MTB免疫逃逸過程起著極其重要的作用。因此，闡明MTB逃逸機制，將有助于為結核病預防和治療找到新的策略和思路。

在MTB感染過程中，活化的巨噬細胞可釋放大量的炎癥介質，如TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS等從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用，進而刺激宿主產生抵抗MTB的免疫反應，對MTB的殺滅和清除發(fā)揮十分重要的作用。由于炎癥反應對MTB具有特別強的殺傷作用，MTB還能夠釋放多種毒力因子，從而抑制巨噬細胞的炎癥應答反應。炎癥應答的另一個分支是誘導一氧化氮合酶(iNOS)的合成，在巨噬細胞介導的宿主抵抗反應中起著十分重要的作用。感染的巨噬細胞內iNOS的活性隨時間的延長而升高，從而導致NOS的催化底物NO的含量增加。因此，iNOS可催化巨噬細胞中NO和活性氮介質的釋放，可激活巨噬細胞殺滅胞內細菌[1]。Chart等[2]研究報道，活化的小鼠巨噬細胞產生的NO能夠有效殺死致病的MTB。

MicroRNAs(miRNAs)是一類物種間高度保守的、非編碼、長度為20～24 nt的單鏈小分子RNA，可通過與靶基因mRNA 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)互補配對結合，從而降解靶基因mRNA或者抑制其翻譯，進而在轉錄后水平負向調控靶基因的表達水平，參與調控一系列生物進程。大量文獻報道m(xù)iRNAs廣泛參與固有免疫及炎癥應答的調控[3-4]。越來越多研究發(fā)現MTB入侵巨噬細胞后，miRNAs表達量發(fā)生改變，可通過靶基因調控炎癥反應，進而影響宿主細胞清除MTB[5-6]。然而，關于miR-506-3p的作用機制未見報道?；谏鲜鲅芯浚狙芯拷⒘朔€(wěn)定的BCG感染巨噬細胞模型，著重探討B(tài)CG感染后巨噬細胞中miR-506-3p表達水平的變化情況，闡明在其中發(fā)揮的作用及可能的機制，從而為深入探討B(tài)CG與宿主細胞相互作用的分子免疫機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中科院上海細胞研究所；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司，美國)；Trizol試劑及Lipofectamin2000轉染試劑盒(Invitrogen公司，美國)；RT-PCR試劑盒(Qiagen公司，德國)；反轉錄試劑盒及雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國)；PVDF膜(Millipore公司，美國)；SOCS-3和β-actin抗體(Abcam公司，美國)；ECL發(fā)光試劑(Thermo公司，美國)；TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯免疫試劑盒(RD公司，美國)；miR-506-3p模擬物(mimics)及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1RAW264.7細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)條件下。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，細胞密度適度時進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2制備BCG感染巨噬細胞模型 將處于對數生長期的RAW264.7細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，細胞培養(yǎng)液吹打形成細胞懸液，以2×105cells/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)16～24 h。按照感染復數為10∶1(細菌與巨噬細胞的比例為10∶1)加入細菌懸液，對照組加入等體積的PBS培養(yǎng)基，放在含CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。感染4 h后，以預溫的PBS洗滌2次，以清洗掉沒有被巨噬細胞感染的細菌。之后加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并以此時作為細菌感染的零時。

1.2.3實時熒光定量PCR TRIzol試劑盒抽提上述刺激條件下得到的RAW264.7細胞的總RNA，應用分光光度計測定純度。根據反轉錄試劑盒說明書的操作步驟將總RNA逆轉錄得到cDNA。應用SYBR Green PCR Kit試劑盒測定miR-506-3p的表達量及細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表達水平。采用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)測定各相應條帶的灰度值，以U6和β-actin分別作為miR-506-3p和目的基因的內參基因。

1.2.4Western Blot檢測蛋白表達 收集不同處理組的細胞，經RIPA細胞裂解液獲得各組細胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg細胞總蛋白經過SDS-PAGE凝膠電泳進行分離，之后通過使用轉膜儀將蛋白電轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋的特異性蛋白一抗，置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日，用PBST洗滌膜4次；加入HRP標記的對應的二抗，在室溫條件下孵育1 h，PBST清洗膜3次；增強化學發(fā)光試劑盒(ECL)曝光顯色，并拍照；獲得的蛋白條帶采用凝膠成像分析系統(tǒng)Quantity One軟件進行灰度值分析，并計算目的蛋白與β-actin灰度值的比值。

1.2.5ELISA檢測細胞因子表達 分別收集不同處理組的細胞上清液，采用ELISA方法分別檢測細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平，酶標儀在450 nm處測得OD值。所有操作步驟嚴格根據試劑盒說明規(guī)范進行。

1.2.6一氧化氮(Nitric Oxide, NO)釋放量檢測 收集不同處理組的培養(yǎng)上清，操作過程根據NO檢測試劑盒使用說明進行。取200 L培養(yǎng)上清，加入經室溫平衡的100 L Griess Reagent R1，再加入等體積Griess Reagent R2，充分混勻后，于室溫條件下放置10 min，酶標儀540 nm處測定各樣品的吸光度。

1.2.7CFU計數檢測BCG存活率 巨噬細胞RAW264.7轉染miR-506-3p mimics和Negative Control(NC)24 h，被BCG刺激4 h后，用PBS洗滌3次以清除細胞外細菌。此后，被感染的細胞放置培養(yǎng)箱中在指定的時間內孵育。收集細胞裂解物，并將稀釋后的裂解物接種至含有OADC的Middlebrook 7H10瓊脂平板上培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后，進行菌落計數。

1.2.8生物信息學預測 應用TargetScan 5.1，PicTar和miRanda等生物信息學在線分析軟件進行預測獲得miR-506-3p的靶基因。

1.2.9雙熒光素酶報告實驗 分別將含有野生型(SOCS-3 3′-UTR-WT)和突變型(SOCS-3 3′-UTR-Mut)的報告基因載體、pRL-TK質粒、miR-506-3p mimics及其陰性對照NC分別共轉染到RAW264.7細胞中，轉染48 h后，操作步驟嚴格根據雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進行，并在酶標儀上分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報告基因的活性。各組的相對熒光值以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度比值反映。

2 結 果

2.1MiR-506-3p在BCG感染的巨噬細胞RAW264.7中低表達 首先檢測BCG感染的RAW264.7細胞中miR-506-3p表達量的變化情況，RT-PCR結果顯示，RAW264.7細胞經BCG感染刺激后miR-506-3p的表達水平在BCG干預后的12 h，24 h，48 h逐漸下降，并且隨著處理時間的增加有明顯的降低趨勢(圖1A)，說明BCG感染可引起RAW264.7細胞中miR-506-3p表達量下調。為深入探討miR-506-3p在BCG感染巨噬細胞的免疫應答中的具體作用機制，將其過表達，轉染效率如圖1B所示，細胞轉染miR-506-3p mimics后，miR-506-3p的表達量顯著升高。

A為RT-PCR檢測miR-506-3p的mRNA表達量，與0 h組相比，#P<0.05;B為RT-PCR用于測定miR-506-3p過表達轉染效率，與NC組相比，*P為<0.05。圖1 BCG感染的RAW264.7細胞中miR-506-3p表達量Fig.1 Expression of miR-506-3p in BCG-infected RAW264.7 cell

2.2MiR-506-3p促進BCG感染的RAW264.7細胞中炎癥因子生成 采用RT-PCR測定TNF-α、IL-1β和IL-6促炎細胞因子mRNA水平變化量。如圖2A的結果所示，在BCG感染和未感染的巨噬細胞RAW264.7中，miR-506-3p過表達組中細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平顯著高于NC組，此結果表明miR-506-3p能夠增加BCG刺激的巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達量。進一步用ELISA方法檢測細胞因子分泌情況，見圖2B的結果，在BCG感染和未感染的RAW264.7細胞中，miR-506-3p過表達組相較于NC組，炎癥介質TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平明顯升高，與mRNA的表達趨勢一致。上述結果提示miR-506-3p可正調控BCG感染所激發(fā)的炎癥進程。

A為RT-PCR用于檢測炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達量;B為ELISA用于檢測炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達量;與NC組相比，*P<0.05。圖2 MiR-506-3p對BCG感染的RAW264.7中炎癥因子表達的影響Fig.2 Effects of miR-506-3p on the expression of inflammatory mediators in BCG-infected RAW264.7 cells

2.3MiR-506-3p促進BCG感染后RAW264.7細胞中NO釋放和iNOS表達 NO在抗感染等炎癥應答中發(fā)揮重要介質作用。巨噬細胞吞噬病原體后隨之活化，并可通過NO相關途徑殺滅胞內細菌，進而觀察miR-506-3p是否能夠影響B(tài)CG激活的巨噬細胞NO釋放。Griess法結果如圖3A顯示，相比于NC組，miR-506-3p過表達后NO分泌量明顯上升，說明miR-506-3p可增加NO的釋放。同時測定iNOS的mRNA相對表達量，結果如圖3B所示，過表達miR-506-3p組iNOS表達量比NC組明顯上升，說明miR-506-3p能夠上調iNOS的表達。

A為Griess法用于檢測NO的產生量;B為RT-PCR檢測iNOS的mRNA表達;與NC組相比，*P<0.05。圖3 MiR-506-3p對BCG感染的RAW264.7細胞中NO的釋放和iNOS表達的影響Fig.3 Effects of miR-506-3p on NO production and iNOS expression in BCG-infected RAW264.7 cells

2.4MiR-506-3p抑制RAW264.7細胞中BCG存活率 CFU結果顯示，miR-506-3p過表達組與NC組相比，BCG的存活率明顯下降(圖4)，說明miR-506-3p可顯著抑制胞內BCG存活率，即有利于BCG的清除。

CFU用于測定胞內BCG存活率；與NC組相比，*P<0.05。圖4 MiR-506-3p對巨噬細胞RAW264.7中BCG存活率的影響Fig.4 Effects of miR-506-3p on BCG survival in RAW264.7 cells

2.5MiR-506-3p靶向調控SOCS-3的表達 利用TargetScan 5.1、PicTar和miRanda等生物信息學在線軟件預測miR-506-3p靶基因，初步預測所得miR-506-3p可靶向結合SOCS-3的3′-UTR區(qū)(圖5A)。進一步采用雙熒光素酶活性實驗驗證預測結果，結果發(fā)現，miR-506-3p可顯著抑制SOCS-3 3′-UTR-WT的熒光素酶活性，而對SOCS-3 3′-UTR-Mut熒光素酶活性無明顯變化(圖5B)。進而采用RT-PCR及Western Blot方法證實miR-506-3p對SOCS-3表達的影響，結果顯示過表達miR-506-3p后可顯著降低SOCS-3的mRNA(圖5C)和蛋白水平(圖5D)。綜上，miR-506-3p能夠靶向結合SOCS-3的3′-UTR區(qū)并負調控其表達。

(A)生物信息學預測miR-506-3p靶向結合SOCS-3的3′-UTR區(qū);(B)雙熒光素酶報告實驗評估熒光素酶活性;(C)RT-PCR用于檢測SOCS-3的mRNA表達量;(D)Western Blot用于檢測SOCS-3蛋白表達水平。與NC組相比，*P<0.05；與Control組相比，#P<0.05。圖5 SOCS-3是miR-506-3p的直接靶基因Fig.5 SOCS-3 is a direct target gene of miR-506-3p

3 討 論

MTB感染后，巨噬細胞會通過許多信號通路激活自身，導致釋放大量炎癥細胞因子，從而提高機體的免疫殺傷功能，促使巨噬細胞清除病原菌。TNF-α作為一種重要的信號分子，是觸發(fā)炎癥應答反應的主要炎癥因子。IL-1β和IL-6是引起機體炎癥反應關鍵的細胞因子，可在MTB感染后誘導保護性免疫應答，在宿主免疫中發(fā)揮重要作用。有研究報道BCG感染能夠誘導炎癥因子IL-1β和IL-6的表達[7]。本研究結果揭示，miR-506-3p過表達后可促進BCG刺激RAW264.7細胞中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，從而參與炎癥反應調控進程。

巨噬細胞吞噬MTB后，通過形成吞噬小體，刺激細胞呼吸，從而生產大量活性氮中間體，而這些物質具有很強的細胞毒性，增強對細菌的殺傷力。而活性氮的生成依賴于iNOS。NO是巨噬細胞通過氧依賴途徑分泌生成的能直接殺滅MTB的重要分子[8]。RAW264.7細胞感染BCG后，miR-146a的表達量升高，通過靶向作用于TRAF6抑制NF-κB和MAPK通路的激活，從而導致iNOS的表達和NO的產生降低，促進巨噬細胞中MTB的存活[9]。巨噬細胞經MTB早期分泌蛋白ESAT-6處理后，let-7f的表達量下降，let-7f通過靶向作用于A20調控胞內活性氧與活性氮的表達量，以避免毒性反應的發(fā)生，從而使得胞內MTB存活率升高[5]。miR-155通過靶向調節(jié)C/EBPβ的表達，從而改變NOS2表達及NO的產生，進而影響胞內MTB的生存能力[10]。因此，通過檢測過表達miR-506-3p后NO的釋放情況，以判斷巨噬細胞的殺菌功能。結果揭示，miR-506-3p可顯著增加BCG感染的巨噬細胞中NO的釋放，同時iNOS的表達水平上調?；罨木奘杉毎ㄟ^殺滅胞內細菌也是巨噬細胞抗MTB感染的重要途徑之一。繼而檢測了巨噬細胞內BCG的存活率，結果發(fā)現miR-506-3p過表達后胞內BCG的存活率降低。以上結果揭示miR-506-3p通過促進巨噬細胞的炎癥進程從而抑制巨噬細胞的殺傷，為找尋治療結核分枝桿菌的潛在靶點提供了新的理論基礎。

SOCS(Suppressor of cytokine signaling)家族是細胞因子信號傳導通路的負性調節(jié)因子。SOCS-3通過調節(jié)許多免疫分子的信號，從而參與各種炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現SOCS-3在肺結核患者中高表達[11]；另有研究表明BCG感染能夠誘導巨噬細胞中SOCS-3高表達[12]。與前期研究結果一致，SOCS-3在BCG感染的RAW264.7細胞中明顯上調，且BCG刺激巨噬細胞誘導的SOCS-3和SOCS-1可抑制IFN-刺激的JAK/STAT信號通路[12]。SOCS-3高表達肺結核患者中Th1型細胞因子表達降低[13]。上述結果均已證實miR-506-3p在BCG感染激活的免疫應答中發(fā)揮了重要的調控作用，顯著促進BCG刺激引起的炎癥應答反應，增強了巨噬細胞的殺菌功能，進而促進了BCG在巨噬細胞內的免疫清除。我們又繼續(xù)闡明miR-506-3p引起炎癥因子表達升高的具體調控機制。通過PicTar和TargetScan 5.1等miRNA靶基因預測軟件發(fā)現SOCS-3可能是miR-506-3p的潛在靶點。利用熒光素酶報告實驗進而證實miR-506-3p能夠直接靶向調控SOCS-3的表達。RT-PCR和Western Blot進一步證實miR-506-3p負向調控靶基因SOCS-3的表達。由此表明miR-506-3p通過下調靶基因SOCS-3顯著增加BCG活化的巨噬細胞釋放促炎因子的能力及NO的分泌，揭示miR-506-3p對BCG感染導致炎癥的負性調控作用是通過抑制SOCS-3的表達實現的。

綜上，miR-506-3p在BCG感染刺激巨噬細胞的炎癥應答過程中發(fā)揮非常重要的調控作用，可促進促炎因子的釋放及NO的產生，從而加劇巨噬細胞的殺傷作用，進而抑制BCG在巨噬細胞內的存活和繁殖，其可能作用的分子機制是通過負調控靶基因SOCS-3表達來實現的。MiR-506-3p在BCG感染的巨噬細胞中發(fā)揮的重要作用及其相關機制，為研發(fā)新型結核疫苗及篩選抗結核藥物靶點提供一定的理論依據。

利益沖突：無