張麗嬌 雷敏 劉寧 侯冰 郭銅 薛思明

（長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 130032）

在人類中，非結(jié)核分枝桿菌（NTM）是一個(gè)重要的臨床問題，與顯著的發(fā)病率有關(guān)，其發(fā)生率在全世界范圍內(nèi)都在增加[1]。CD4+T 細(xì)胞的免疫作用在分枝桿菌感染中起至關(guān)重要的作用。結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞，MHC 分子負(fù)責(zé)將菌體抗原遞呈，CD4+T 細(xì)胞接收信息，相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α 大量分泌[2-4]。而有研究表明，CD8+T 細(xì)胞在被菌體感染后也會(huì)出現(xiàn)IFN-γ 等細(xì)胞因子，CD8+T 細(xì)胞的免疫作用在菌體感染中也不容忽視[5-7]。有必要進(jìn)一步研究CD4+、CD8+T 細(xì)胞在NTM 感染過程中的功能。本實(shí)驗(yàn)從牛頜下腺淋巴結(jié)中分離出一種胞內(nèi)分枝桿菌，旨在比較胞內(nèi)分枝桿菌與BCG 菌株的感染特性和宿主免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

C57BL/6 小鼠，雌性，4 周齡，北京華阜康生物科技股份有限公司；TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-12 的ELISA 檢測(cè)試劑盒，R&D 公司；BCG 菌株、胞內(nèi)分枝桿菌，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫與微生物實(shí)驗(yàn)室提供；膠原酶XI，Sigma 公司；7H9 培養(yǎng)基、CD3 抗體 (Rat Anti-Mouse)、CD4 抗體 (Rat Anti-Mouse)、CD8 抗體(Rat Anti-Mouse)、BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胞內(nèi)分枝桿菌在小鼠肺內(nèi)的增殖

用對(duì)照菌株BCG 和分離的胞內(nèi)分枝桿菌腹腔感染小鼠（1×106菌體/小鼠）。感染過程設(shè)15、30、45 和60d 4 個(gè)檢測(cè)時(shí)間段，并設(shè)空白對(duì)照組。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有5 只動(dòng)物受到感染。通過用稀釋的肺臟勻漿在7H9 培養(yǎng)基上檢測(cè)細(xì)菌增殖率。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺CD3+CD4+、CD3+CD8+T 細(xì)胞的變化

肺組織用膠原酶XI 消化，得到肺單細(xì)胞懸液[8-9]。細(xì)胞（1×105/管）在4℃條件下用分別用CD3 抗體、CD4 抗體、CD8 抗體單克隆抗體孵育20min[10]。流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)染菌后15、30、45 和60d CD3+CD4+、CD3+CD8+T 細(xì)胞比例。

1.2.3 Elisa 法檢測(cè)血清中IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表達(dá)

收集小鼠血清并在-80℃冷凍，用Elisa 試劑盒檢測(cè)IFNγ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Graphpad Prism 5.0 軟件作圖并分析數(shù)據(jù)。C6 流式軟件制作流式圖，用T 檢驗(yàn)比較組間差異。＜0.05 表示有差異，用*表示；＜0.01 表示差異顯著，用**表示，＜0.001 表示差異極顯著，用***表示。

2 結(jié)果

2.1 胞內(nèi)分枝桿菌在小鼠肺內(nèi)的增殖

感染胞內(nèi)分枝桿菌和BCG 菌株導(dǎo)致15d 時(shí)肺部嚴(yán)重感染（見圖1），但細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，到60d 時(shí)基本清除（見圖2）。感染胞內(nèi)分枝桿菌組的細(xì)菌數(shù)量大于BCG 菌株組（＜0.01）（見圖2）。

圖1 小鼠感染菌體15d 后肺組織抗酸染色切片（×200）

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺CD3+CD4+、CD3+CD8+ T細(xì)胞的變化

在感染胞內(nèi)分枝桿菌的小鼠中，CD3+CD4+T 細(xì)胞大量涌入，與其他組相比，30d 的數(shù)量達(dá)到最高水平（＜0.010），然后下降（圖3）。但BCG 感染組CD3+CD4+T 細(xì)胞并沒有迅速減少（圖3）。胞內(nèi)分枝桿菌組在45、60d 時(shí)CD3+CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量最多，與其他組相比（＜0.010）（圖4）。這些結(jié)果與15d 時(shí)組織病理學(xué)分析相一致，我們觀察到更多的胞內(nèi)分枝桿菌感染小鼠的淋巴細(xì)胞損傷。

圖3 胞內(nèi)分枝桿菌感染對(duì)小鼠肺CD3+CD4+T 細(xì)胞表達(dá)的影響

圖4 胞內(nèi)分枝桿菌感染對(duì)小鼠肺CD3+CD8+T 細(xì)胞表達(dá)的影響

2.3 Elisa 法檢測(cè)血清中IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表達(dá)

在感染小鼠的血清中，IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表達(dá)表明從感染第15 天開始，感染胞內(nèi)分枝桿菌小鼠的血清中含有更多的IFN-γ。30d 胞內(nèi)分枝桿菌的IFN-γ 水平高于其他組（＜0.001），45、60d 時(shí)IFN-γ 表達(dá)下降明顯。進(jìn)一步分析顯示，TNF-α 和IL-12 的表達(dá)結(jié)果與IFN-γ 相似。此外，感染胞內(nèi)分枝桿菌的小鼠中IL-10 高于BCG 組和空白對(duì)照組，特別是在30d 后IL-10 表達(dá)下降不明顯（＜0.001）（如圖5）。

圖5 胞內(nèi)分枝桿菌感染對(duì)小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 表達(dá)的影響

3 討論

在過去的幾十年里，研究者已經(jīng)闡明對(duì)NTM 感染所激活的宿主免疫機(jī)制，但研究成果有限[11,12]。還需要進(jìn)一步研究來調(diào)查NTM 的流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)和宿主免疫機(jī)制，特別是CD4+T、CD8+T 細(xì)胞相關(guān)的免疫機(jī)制，CD4+T 細(xì)胞在感染過程中主要對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫保護(hù)，并分泌保護(hù)細(xì)胞因子，而CD8+T 細(xì)胞在感染過程中主要起毒性殺傷及抑制作用。

通過菌體增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胞內(nèi)分枝桿菌與BCG 相比在肺部生長(zhǎng)得更快，特別是15d 時(shí)數(shù)量較多，抗酸染色也觀察到感染小鼠肺內(nèi)菌體。但數(shù)量不斷減少，在感染60d 時(shí)數(shù)量已經(jīng)非常少。這可能與機(jī)體免疫機(jī)制及菌體毒力相關(guān)，有些菌體被排出體外，有些菌體存活下來，對(duì)機(jī)體造成損傷。

該項(xiàng)研究調(diào)查了宿主對(duì)胞內(nèi)分枝桿菌感染的CD4+T、CD8+T 細(xì)胞相關(guān)的免疫機(jī)制。結(jié)果表明，在15d 后，肺部感染因胞內(nèi)分枝桿菌誘導(dǎo)的CD4+T 細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)而減慢，并有高水平的TNF-α、IL-12 和IFN-γ 產(chǎn)生。但在30d 后，CD4+T反應(yīng)隨著CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)的大量出現(xiàn)而下降。一些免疫抑制性細(xì)胞因子，如IL-10，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量并沒有下降，IL-10 先前已被證實(shí)，在分枝桿菌感染期間對(duì)TNF-α 和IFN-γ 的產(chǎn)生有副作用[13]；因此，我們觀察到從第30 天開始，TNF-α 和IFN-γ 的誘導(dǎo)率較低，這可能與高水平的IL-10 產(chǎn)物出現(xiàn)有關(guān)。而BCG 組在感染全過程都以CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)為主，同時(shí)抑制CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，并且相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)也是這個(gè)趨勢(shì)。說明在不同菌體感染機(jī)體過程中，CD4+T 細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞相應(yīng)的免疫作用也不同，這也能與菌體毒力等因素有關(guān)。這些研究有助于提高我們對(duì)NTM 的深入理解，為治療NTM 感染提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。