張錚峰，張冰純，王盼盼，陳定強(qiáng)，趙路寧，余 琳

香港海鷗型菌屬原核細(xì)菌(Proteobacteria)I3亞綱，奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)，學(xué)名為香港海鷗型菌(Laribacterhongkongensis，LH)。它是新發(fā)現(xiàn)的被證實(shí)與社區(qū)性胃腸炎和旅行者腹瀉有關(guān)的細(xì)菌[1]。它和產(chǎn)酸克雷伯菌 (Klebsiellaoxytoca)、產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌 (EnterotoxigenicBacteroidesfragilis,ETBF) 被美國學(xué)者確認(rèn)為21世紀(jì)來新發(fā)現(xiàn)的3種可以引起人急性腹瀉的病原菌[2]。淡水魚和蛙類是該菌的主要宿主[3]。在2012年，我們課題組在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的門診腹瀉病人糞便標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)多重耐藥的香港海鷗型菌[4]，命名為HLGZ1，此菌對革蘭氏陰性桿菌的臨床常用抗生素均耐藥，因此我們開始觀察其他類抗生素(如紅霉素等)的耐藥情況，以及紅霉素耐藥相關(guān)基因ereA、ereB、ermA、ermB、ernC、MefA/E、mphA、SAT4、MsrA的攜帶情況，分析該菌對紅霉素耐藥的基因狀態(tài)，以便進(jìn)一步為臨床正確用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 2016年1-9月期間，從廣州8個(gè)不同的零售市場采集草魚和青蛙腸道標(biāo)本，通過分離培養(yǎng)，生化鑒定和香港海鷗型菌16S rRNA基因特異性序列測序，最終確定122株為香港海鷗型菌株，由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科保存。其中魚源株85株，蛙源株37株。

1.1.2主要試劑 血瓊脂平板、紅霉素藥敏紙片(環(huán)凱公司)，MH平板、營養(yǎng)肉湯(生物梅里埃公司)，DNA提取試劑盒、200 bp Maker Ⅲ(天根有限公司)。引物合成自生工生物工程(上海)股份有限公司，PremixTaqDNA 聚合酶為TaKaRa 公司產(chǎn)品。

1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸埃希氏菌ATCC25922 和金黃色葡萄球菌ATCC25923由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科保存，并作為藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

1.1.4主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(伯樂公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene 公司)、生物安全柜(Thermo公司產(chǎn)品)、生物培養(yǎng)箱LRH-250A(廣州醫(yī)療器械廠)、低溫超速離心機(jī)(Eppendorf公司)、電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器廠)和0.5麥?zhǔn)媳葷醿x(梅里埃公司)。

1.2 方 法

1.2.1紅霉素的耐藥性測定 按照CLSI的紙片擴(kuò)散法(K-B法)測定122株香港海鷗型菌對紅霉素的敏感性。使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈并記錄，結(jié)果判讀根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.2DNA模板的制備 采用天根柱式DNA提取試劑盒，按照說明書提取菌體DNA。將提取的模板DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3紅霉素耐藥基因檢測

1.2.3.1引物 參照文獻(xiàn)[5-7]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成ereA，ereB，ermA，ermB，ernC，MefA/E,mphA,SAT4紅霉素耐藥基因的引物。

1.2.3.2PCR反應(yīng)體系的配置 反應(yīng)體系共25 μL，其中包括12.5 μL pcr mixTaqDNA聚合酶、10.5 μL雙蒸水、上下游引物各0.5 μL和1 μL DNA模板。PCR 反 應(yīng) 條 件 為：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性 30 s， 50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，34 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸 3 min。

1.2.3.3PCR產(chǎn)物分析 取0.6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于1.5%瓊脂糖凝膠中(使用DD染料配制)，在130 V電壓下電泳15 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存圖片。

2 結(jié) 果

2.1藥敏結(jié)果 122株香港海鷗型菌對紅霉素耐藥率為29.5%(見表1)。

表1 122株香港海鷗型菌的耐藥性
Tab.1 Drug resistance of LH(122)

抗生素名稱魚源株(n=85)蛙源株(n=37)合計(jì)(n=122)耐藥株耐藥率%耐藥株耐藥率%耐藥株耐藥率%紅霉素2225.91335.13528.7

2.2耐藥基因分布 只在蛙源耐藥株中檢出紅霉素抗性基因ereA，檢出率為30.8%，提示海鷗菌蛙源株對紅霉素產(chǎn)生的耐藥性與ereA基因相關(guān)(見表2)。

2.3耐藥基因檢測結(jié)果 420 bp處出現(xiàn)ereA目標(biāo)條帶(見圖1)。

注：M為Marker；1為ereA(420 bp)；3為ereA(420 bp)；4為ereA(420 bp)圖1 耐藥基因(ereA)PCR電泳結(jié)果Fig.1 PCR result of resistance gene(ereA)

表2 耐藥基因攜帶情況
Tab.2 Carriage of durg-resistance genes

抗生素基因魚源株(n=22)蛙源株(n=13)合計(jì)(n=35)檢出株檢出率(%)檢出株檢出率(%)檢出株檢出率(%)ereA00430.8411.4ereB000000ermA000000ermB000000紅霉素ermC000000MefA/E000000msrA000000mphA000000Sat4000000

2.4部分基因測序結(jié)果 通過與GenBank上的ereA基因(編號AF466410.1)比對，同源性達(dá)99%(圖2)。

圖2 測序結(jié)果Fig．2 Sequencing result

3 討 論

由于廣東省地處珠江三角洲地區(qū), 毗鄰香港，屬亞熱帶氣候,溫?zé)岫嘤? 居民素喜食魚、蝦、蟹等淡水產(chǎn)品, 因此，存在引發(fā)人群食源性疾病的潛在危險(xiǎn)。目前國內(nèi)和國外均有香港海鷗型菌所致人胃腸炎的臨床病例報(bào)道,香港地區(qū)為首次報(bào)道從社區(qū)胃腸炎患者糞便中培養(yǎng)出香港海鷗型菌[1]；我國內(nèi)地浙江省杭州市及廣東省江門市均發(fā)現(xiàn)腹瀉患者大便標(biāo)本中存在該菌，并確定該菌是患者腹瀉的病原菌[8-9]，香港海鷗型菌在世界各國如丹麥、美國、韓國等地均有人體感染致腹瀉或胃腸炎的報(bào)道[10-12]，說明香港海鷗型菌是導(dǎo)致人類腹瀉病原菌之一，而且作為一種新發(fā)現(xiàn)的病原菌，在世界范圍內(nèi)廣泛存在，但其致病機(jī)制與耐藥機(jī)制尚不明確。在2012年，我們團(tuán)隊(duì)在腹瀉病人糞便發(fā)現(xiàn)泛耐藥HLGZ1中存在很多耐藥基因，插入序列和I類整合子等元件，表明耐藥基因在香港海鷗型菌中存在水平傳播的現(xiàn)象[4]。

目前，我國濫用抗生素的情況依然十分嚴(yán)重，多重耐藥甚至泛耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)應(yīng)當(dāng)起人們的警惕。故本課題組開展香港海鷗型菌紅霉素耐藥性研究對于預(yù)防和治療其引起的感染具有重要意義。本研究122株香港海鷗型菌中對紅霉素耐藥株有35株，耐藥率達(dá)28.7%，表明香港海鷗型菌對紅霉素耐藥較為嚴(yán)重。這與以往廣州地區(qū)研究結(jié)果相吻合，如王祉蘊(yùn)等[13]分離的54株LH中有15株對紅霉素耐藥，耐藥率為27.78%；王麗等[14]分離的122株海鷗菌有23株對紅霉素耐藥，耐藥率為18.9%。但不同地區(qū)間有差異，馮梅等[15]在深圳地區(qū)分離的108株LH中有6株對紅霉素耐藥，耐藥率為5.56%。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)蛙源株對紅霉素的耐藥率比魚源株要高；同時(shí)檢測常見導(dǎo)致細(xì)菌紅霉素耐藥的基因：ereA和ereB(通過表達(dá)紅霉素酯酶使紅霉素酯解失活引起細(xì)菌耐藥)、ermA、ermB和ermC(通過表達(dá)紅霉素甲基化酶，導(dǎo)致細(xì)菌核糖體23sRNA基因甲基化，紅霉素對其作用失效而耐藥)、MeFA/E(編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將紅霉素類藥物泵出細(xì)菌細(xì)胞外而導(dǎo)致耐藥)和mphA(其表達(dá)產(chǎn)物可以使紅霉素脫氧二甲胺己糖C-2位置發(fā)生磷酸化或糖基化而失去活性)。結(jié)果只在蛙源耐紅霉素株中檢出其相關(guān)抗性基因ereA，檢出率為30.8%，提示海鷗菌蛙源株對紅霉素產(chǎn)生的耐藥性與ereA基因相關(guān)，可能通過ereA基因表達(dá)紅霉素酯酶使紅霉素酯解失活，引起對紅霉素耐藥；而紅霉素耐藥的魚源株耐藥性與ereA無關(guān)。

香港海鷗型菌自發(fā)現(xiàn)至今已有18年，大部分的文獻(xiàn)報(bào)道均針對該菌的分離情況和表型進(jìn)行研究。近年來開始對該菌的致病機(jī)制和耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究。而該菌對紅霉素耐藥及傳播機(jī)制仍不明確，國內(nèi)外均無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究通過對香港海鷗型菌紅霉素耐藥株的相關(guān)耐藥基因ereA，ereB，ermA，ermB，ernC，MefA/E，mphA，SAT4進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究香港海鷗型菌對紅霉素的耐藥機(jī)制和臨床防治耐藥株提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

香港海鷗型菌的主要宿主是水產(chǎn)品(淡水魚和蛙)，多種抗生素耐藥菌的出現(xiàn)應(yīng)引起養(yǎng)殖業(yè)對濫用抗生素的警惕，建議對抗生素市場進(jìn)行更嚴(yán)格的監(jiān)管。

利益沖突：無