杜曉芳，李兆周，陳秀金，王耀，高紅麗，李道敏，任國艷，呂璞

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品加工與安全國家級實驗教學(xué)示范中心/河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南洛陽471000）

喹諾酮類藥物是一類重要的人工合成抗菌藥物，具有抗菌譜廣、活性強、組織穿透力強、價格低廉和交叉耐藥性低等特點，廣泛應(yīng)用于抗感染治療中[1-3]。過去的幾十年，喹諾酮類藥物在畜禽及水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的不合理使用，導(dǎo)致其在動物性食品及環(huán)境中的殘留量超標(biāo)，嚴(yán)重威脅人類健康，常見的不良反應(yīng)包括骨髓發(fā)育不全、過敏反應(yīng)和腸道微生態(tài)的改變等[4-9]，該類藥物的殘留檢測已成為亟待解決的問題之一。目前常見的喹諾酮類藥物殘留檢測方法有微生物法[10]、免疫分析法[11-13]、色譜法[14]、電化學(xué)分析法[15-16]、光譜法[17]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18-19]等。但由于樣品基質(zhì)復(fù)雜多樣，常規(guī)單一方法對于該類藥物的檢測存在一定的局限性，如微生物法難以定量；免疫分析法易出現(xiàn)假陽性且不穩(wěn)定；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測成本昂貴等。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏且高效的方法用于樣品中喹諾酮類藥物殘留的檢測迫在眉睫。

分子印跡技術(shù)是一種具有特定選擇性和親和能力的新興聚合技術(shù)。通過分子印跡技術(shù)制備的具有類似抗體或酶專一性的仿生識別材料稱為分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs），也稱為印跡仿生抗體[20]。分子印跡仿生抗體因具有結(jié)構(gòu)預(yù)定性、實用性、穩(wěn)定性好及制備簡單的優(yōu)點，能特異性識別靶物質(zhì)，對極端環(huán)境具有很強的耐受能力，可代替生物源識別元件用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的定性和定量分析[21]。目前，該仿生識別材料已廣泛應(yīng)用于色譜、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）[22-23]、模 擬 酶[24-25]、仿 生 傳 感器[26-27]、膜分離[28-29]和臨床藥物分析等領(lǐng)域，同時也在食品、環(huán)境和生物樣品的分離、純化和富集分析中展示出廣闊的應(yīng)用前景。

仿生免疫分析是利用分子印跡仿生抗體的特異性識別能力而建立的一種親和分析方法，是近幾年研究的熱點之一，如Chen 等[30]報道了一種以分子印跡仿生抗體作為抗體替代物的仿生酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其檢測范圍為5～1000μg/mL，加標(biāo)牛血清樣品回收率達89.00%～102.30%；Yao 等[31]報道了一種新型仿生納米酶用于檢測過氧化氫，具有10μmol/L～4mmol/L 的寬線性范圍，檢測限達5μmol/L。本文主要介紹喹諾酮類藥物印跡仿生抗體的制備方法，總結(jié)其在食品與環(huán)境檢測中的應(yīng)用；結(jié)合分子印跡技術(shù)的最新研究進展，討論了該類藥物仿生抗體在制備及識別過程中面臨的問題，提出了可能的解決途徑與方案，為新型印跡仿生抗體的研制及應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)途徑。

1 喹諾酮類藥物印跡仿生抗體的制備方法

目前喹諾酮類藥物印跡仿生抗體的制備方法主要有本體聚合法、分散聚合法、懸浮聚合法、原位聚合法和表面分子印跡法等。不同制備方法所得印跡仿生抗體的性能參數(shù)比較見表1。

由表1可看出，制備出的喹諾酮類藥物印跡仿生抗體的形態(tài)主要有塊狀、球狀和薄膜等幾種，不同制備方法的印跡效率不同。表中本體聚合法的印跡因子較高，但其檢測回收率卻不如其他制備方法，可能是合成印跡仿生抗體時的研磨過程破壞了部分識別位點的空間排列；模板分子的包埋現(xiàn)象使模板分子洗脫不徹底，在吸附過程中仍然占據(jù)部分孔穴，致使其吸附選擇性降低。因此，如何完善和創(chuàng)新現(xiàn)有制備技術(shù)來提高印跡效率和檢測回收率是分子印跡領(lǐng)域亟待解決的問題。下面就每種制備方法的特點進行詳細介紹。

1.1 本體聚合法

本體聚合法是最傳統(tǒng)和常用的制備方法，通常是在熱引發(fā)或紫外光照射的條件下，合成高度交聯(lián)的塊狀MIPs。孫慧等[32]以氧氟沙星（ofloxacin，OFL）作為模板分子，MAA 為功能單體，PETRA為交聯(lián)劑和2, 2- 偶氮二異丁腈 （2, 2-azobisisobutyronitrile，AIBN）為引發(fā)劑，在紫外光照射條件下合成MIPs，而且該MIPs 能夠?qū)Ｒ恍杂行?識 別OFL。 Benito-Pe?a 等[33]以 恩 諾 沙 星（enrofloxacin，ENR）為模板，通過熱引發(fā)制備了一種新型水相容性MIPs，用于在水中選擇性提取氟喹諾酮類藥物（fluoroquinolone drugs，F(xiàn)Qs）。但傳統(tǒng)的本體聚合法需要經(jīng)過研磨篩分得到所需大小的粒子，費時費力，產(chǎn)率一般低于50%，后處理過程易破壞識別位點結(jié)構(gòu)，且形成的微粒形態(tài)不規(guī)則，多呈分散性。

表1 喹諾酮類藥物印跡仿生抗體的制備方法及性能參數(shù)

1.2 懸浮聚合法

懸浮聚合法是指將溶有引發(fā)劑的功能單體以液滴狀懸浮于水中進行自由基聚合的方法。此種方法的制備工藝簡單，所得MIPs 的形態(tài)規(guī)則、比表面積大、吸附和識別性能較強，是制備聚合物微球最簡便和最常用的方法之一。陳令濤等[34]以環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）為模板分子，使用懸浮聚合法制備MIPs，結(jié)果表明在最優(yōu)條件下飽和吸附量可達210.6mg/g，經(jīng)5 次再生后吸附量仍能達到初始吸附量的92.3%。懸浮聚合法所得聚合物微球粒徑較大，是親和SPE的理想填料，但該方法易造成模板分子包埋過深，難于洗脫，以致模板分子泄漏，影響分析方法的精確性。

1.3 原位聚合法

原位聚合法是將預(yù)聚合溶液注入到色譜柱或毛細管柱等反應(yīng)容器中直接聚合得到連續(xù)棒狀MIPs，該方法制備簡便，避免了傳統(tǒng)制備方法中磨碎等步驟，在線洗脫后可直接應(yīng)用，重復(fù)性得到顯著提高。李兆敏等[35]用原位聚合法合成了CIP 分子印跡整體柱，該法簡便經(jīng)濟，得到的MIPs直徑在0.2～0.5μm之間，具有良好的均一性和連續(xù)性。

傳統(tǒng)原位聚合方法制得的分子印跡整體柱的裝樣量少、選擇性略差、效率不夠高且易產(chǎn)生壁流。為改善這一缺點，可選擇室溫離子液體做溶劑及致孔劑應(yīng)用于MIPs 的制備。室溫離子液體不僅具有優(yōu)異的溶劑化質(zhì)量、可變的黏度范圍、較低的蒸汽壓和優(yōu)異的化學(xué)熱穩(wěn)定性等特性，并可加速聚合物合成速率、提高聚合物特異性識別和結(jié)合能力。Sun等[36]在室溫離子液體[BMIm]BF4中采用室溫離子液體介導(dǎo)原位聚合技術(shù)，以諾氟沙星（norfloxacin，NFX）為模板，制備出一種新型MIPs。利用該MIPs 作為SPE 填料，建立了分子印跡固相萃取偶聯(lián)高效液相色譜法（molecularly imprinted solidphase extraction coupling with high performance liquid chromatography，MISPE-HPLC），用于檢測動物組織樣品中痕量的FQs，回收率可達78.16%～93.50%。

通過原位聚合法也可以制備仿生傳感器的識別元件，實現(xiàn)靶物質(zhì)的特異檢測。Luo 等[37]以CIP 為模板分子，采用原位光引發(fā)聚合法制備了納米級仿生印跡膜，作為表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器的識別元件，用于CIP 的檢測（制備流程見圖1）。在10-11～10-7mol/L濃度范圍內(nèi)，該傳感器的線性相關(guān)系數(shù)為0.96，檢測限為0.08μg/L，具有靈敏度高、檢測限低、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

圖1 原位光引發(fā)聚合法制備等表面等離子共振傳感識別元件［37］

1.4 沉淀聚合法

沉淀聚合法是一種操作簡便、成本低、產(chǎn)率高且印跡效果較好的方法，得到的微球顆粒較小、比表面積大且吸附性能優(yōu)異。張莉等[38]采用沉淀聚合法，以四環(huán)素和NFX 為模板分子，制備仿生識別材料，作為SPE吸附劑檢測蜂蜜和奶制品中的藥物殘留，加標(biāo)回收率為82.12%～96.51%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%，檢測限為0.2ng/g。Benito-Pe?a等[39]以ENR 為模板分子，MAA 為功能單體，2-甲基丙烯酸羥甲基酯為親水性共聚單體，應(yīng)用沉淀聚合法制備出具選擇性識別能力的單分散MIPs微球，尺寸可控制在2～3μm范圍內(nèi)。Wu等[40]以異硫氰酸熒光素為發(fā)光材料，采用沉淀聚合法合成熒光分子印跡納米粒子，檢測水樣中的CIP。結(jié)果顯示，方法檢測線性范圍較寬，為4.04～250nmol/L，熒光特性檢測限為4.04nmol/L，在一定程度上發(fā)揮了分子印跡技術(shù)的應(yīng)用潛力，見圖2。

1.5 溶膠-凝膠法

溶膠-凝膠技術(shù)具有可低溫合成與處理、操作簡單方便、產(chǎn)品均勻度高、純度高等特點。杜麗麗等[41]以加替沙星為模板分子，采用溶膠-凝膠分子印跡技術(shù)，在水相中合成具有分子識別作用的新型有機-無機雜化仿生抗體材料，并以此為固相填料專一性檢測牛奶中的加替沙星，回收率可達79.87%，檢測限為1.12μg/L。Wang 等[42]以ENR 為模板，APTES 為功能單體，TEOS 為交聯(lián)劑制備分子印跡功能化溶膠-凝膠，檢測魚肉和雞肉中痕量的ENR，回收率可達70.00%～82.00%。通過溶膠-凝膠法制備的新型雜化仿生材料兼顧了溶膠-凝膠和分子印跡技術(shù)二者的優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)分子印跡仿生材料的剛性與惰性較差的缺點，正逐漸成為分子印跡技術(shù)的一個重要研究方向。

1.6 表面分子印跡

圖2 熒光分子印跡納米粒子的制備流程［40］

表面分子印跡是指在固體基底表面發(fā)生聚合反應(yīng)，使印跡位點分散在MIPs或有機化合物的表面，克服了印跡位點包埋過深、模板分子難于洗脫的缺陷，加快識別位點與印跡分子的結(jié)合速率，進一步加強印跡材料吸附和分離效率。賀永桓等[45]以O(shè)FL為模板分子，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒為載體，采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合方法，制備出具有高選擇性、快速識別和磁操控的核殼型分子印跡納米材料。同樣，Wang 等[43]以CIP 為模板，F(xiàn)e3O4為磁性材料，羧化纖維素納米晶體為載體，共聚合制備MIPs，選擇性吸附容量可達50mg/g，具有適宜的飽和磁化強度，可同時應(yīng)用于6種FQs的選擇性識別。與傳統(tǒng)的制備方法相比，磁性表面MIPs 解決了傳統(tǒng)MIPs 模板分子包埋過深、洗脫難的問題，且結(jié)合位點在磁性載體表面，比表面積大、選擇性高。但可能存在MIPs 對磁載體的包裹不完全，易發(fā)生磁泄漏問題。因此，提高仿生抗體對磁性微粒的包裹率，減少磁泄漏，是提高磁性表面MIPs 穩(wěn)定性的關(guān)鍵。此外，表面分子印跡法也可以選擇硅膠、有機聚合物載體及毛細管等材料作為基質(zhì)進行聚合反應(yīng)。Zdunek 等[44]以ENR 為模板在多孔氧化鋁中制備納米絲結(jié)構(gòu)仿生材料，開發(fā)出一種新的光學(xué)傳感器對ENR 進行特異性分析檢測。該方法簡便，重現(xiàn)性好，用于水樣中ENR 的檢測，檢測限為0.58μmol/L。

1.7 其他合成方法

近幾年研究者們也逐漸探索出一些新型的方法來合成喹諾酮類藥物印跡仿生抗體。Wang 等[46]開發(fā)出一種MIPs薄膜（模式圖如圖3所示），將其作為仿生抗體，建立一種直接競爭仿生酶聯(lián)免疫方法檢測動物食品中的ENR，回收率為74.40%～86.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.3%～8.0%范圍內(nèi)。該方法結(jié)合了分子印跡技術(shù)和酶聯(lián)免疫技術(shù)的優(yōu)點，經(jīng)濟可靠、使用簡便，具有廣闊的應(yīng)用前景，但該方法的特異性和抗干擾能力仍待優(yōu)化，MIPs 膜的理化特性，特別是識別能力、柔韌性和穩(wěn)定性仍需深入研究。

2 喹諾酮類藥物印跡仿生抗體在食品及環(huán)境檢測中的應(yīng)用進展

喹諾酮類藥物印跡仿生抗體作為一種基于分子識別的高聚物，常被用作SPE填料及仿生傳感器的識別元件，應(yīng)用于食品及環(huán)境樣品中喹諾酮類藥物的殘留檢測。喹諾酮類藥物印跡仿生抗體用于實際樣品的檢測見表2。

由表2可知，喹諾酮類藥物印跡仿生抗體應(yīng)用于實際樣品的檢測方法主要有MISPE-HPLC、MIMSPD-HPLC、電化學(xué)傳感器和光學(xué)傳感器等幾種方式；檢測的樣品包括食品（肉、蛋及奶）和環(huán)境（土壤和水樣）等領(lǐng)域。結(jié)果顯示，上述各種分析檢測方法的回收率較高，檢測限最低可達8.985×10-5μg/kg。

圖3 分子印跡薄膜的制備過程［46］

表2 喹諾酮類藥物印跡仿生抗體用于實際樣品的檢測

2.1 肉品中喹諾酮類藥物殘留檢測

將制備的MIPs 作為一種SPE 吸附填料，可以較好地克服樣品復(fù)雜所帶來的內(nèi)源性干擾問題，實現(xiàn)對殘留藥物的特異性分離和富集。蘭翠娟[47]以雙模板MIPs制備SPE柱，結(jié)合HPLC方法檢測樣品中的FQs，對7 種FQs 的日間回收率為76.50%～91.80%，日內(nèi)回收率為78.00%～93.10%。與單模板分子的MIPs相比，雙模板MSPE-HPLC 用于FQs的殘留檢測更加簡便和準(zhǔn)確。

熒光標(biāo)記技術(shù)也可用于MIPs 的制備。Tang等[48]應(yīng)用局部光聚合法制備多功能MIPs 熒光探針，用于FQs 的檢測（探針制備如圖4 所示）。該熒光探針不僅具有良好的磁性和優(yōu)異的選擇識別能力，還具有快速和靈敏的優(yōu)點，用于魚類組織中5 種FQs的檢測，回收率可達90.33%～108.43%。

2.2 蛋品中喹諾酮類藥物殘留檢測

對禽蛋中的FQs進行分析檢測比較復(fù)雜，因為藥物可能與蛋類中的脂蛋白結(jié)合、萃取溶劑與蛋基質(zhì)也易形成乳液和泡沫，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。常規(guī)方法包括液-液萃取、固相（微）萃取、超臨界流體萃取等樣品制備方法應(yīng)用于分析禽蛋中的FQs，具有相對較低的回收率、繁瑣的提取程序且無法同時提取多種FQs 等缺點?；|(zhì)固相分散（matrix solid-phase dispersion，MSPD）是可以同時破碎、提取和凈化固體、半固體或高黏度生物樣品的最有前景的技術(shù)之一，可以解決液-液或固相萃取技術(shù)檢測分析復(fù)雜生物樣品中的缺點。MIPs 作為選擇性MSPD吸附劑可用于環(huán)境和生物樣品中的痕量FQs分析，具有靈敏度高、特異型強和精密度高等優(yōu)點。Yan 等[49]提出一種高選擇性的分子印跡-基質(zhì)固相分散（molecular imprinting and matrix solid phase dispersion，MI-MSPD）多重分析方法。首次使用制備的仿生抗體材料作為特定的MSPD吸附劑，結(jié)合HPLC方法測定和分析雞蛋和組織樣品中的5 種FQs，該方法可消除基質(zhì)干擾，顯著提高對藥物檢測的選擇性和靈敏度，回收率可達85.70%～104.60%。

2.3 奶中喹諾酮類藥物殘留檢測

分子印跡仿生抗體也可與HPLC、毛細管電泳和高效液相色譜-質(zhì)譜等儀器聯(lián)用，應(yīng)用于乳及乳制品中藥物的殘留檢測。Kaur等[50]建立了一種高效的MISPE-熒光光譜法，可靈敏測定牛奶中的單諾沙 星，檢 測 限 達2.0×10-9mol/L。Wang 等[51]應(yīng) 用MISPE-HPLC方法測定牛奶中FQs殘留，基于NFX的MIPs 固相萃取柱對4 種藥物（CIP、NFX、ENR和洛美沙星）顯示出較高的吸附容量（≥4520ng）和回收率（≥96.00%）。此外，該SPE柱與市售SPE柱相比具有更好的凈化效果和重復(fù)性，可以重復(fù)使用50次以上。多模板制備的MIPs 同時測定乳及乳制品中多種殘留藥物，更加靈敏、快速。Zhang等[52]以O(shè)FL和17β-雌二醇為模板，改性單分散聚珠為載體，合成一種多模板表面MIPs，作為SPE 吸附劑同時測定牛奶樣品中的痕量喹諾酮類和雌激素類物質(zhì)，回收率達77.60%～98.00%。

Yuphintharakun 等[53]以CIP 為模板分子，通過溶膠-凝膠法合成仿生抗體。然后將羧酸功能化的多壁碳納米管和嵌入仿生抗體內(nèi)的CdTe 量子點組成納米復(fù)合光傳感器（構(gòu)建原理圖如圖5 所示），用于雞肉和牛奶中CIP的檢測，具有高靈敏度、特異選擇性和高親和力等特點，檢測限為0.066μg/L，回收率可達82.60%～98.40%。

圖4 多功能分子印跡熒光探針的制備流程［48］

2.4 環(huán)境中喹諾酮類藥物蓄積檢測

土壤及水體中抗生素的殘留和蓄積已成為一個新出現(xiàn)的環(huán)境問題，對土壤、水體安全以及全球公共衛(wèi)生構(gòu)成的威脅越來越大，亟需建立新方法進行檢測。

MISPE已用于環(huán)境樣品中殘留藥物的樣品前處理，實現(xiàn)環(huán)境樣品（水體、土壤和尿液等）中靶物質(zhì)的選擇性萃取。Qu等[54]分別以CIP和ITA為模板分子和功能單體，在金屬離子介導(dǎo)下合成一種新型MIPs，用作SPE 吸附劑檢測水樣中4 種FQs 和2 種四環(huán)素藥物，回收率可達78.60%～113.60%。與傳統(tǒng)MIPs相比，該MIPs可顯著增強印跡效應(yīng)并具有更強的特異性吸附能力。Barahona 等[55]提出在聚丙烯中空纖維（polypropylene hollow fibers，HFs）孔中填充MIPs（制備方案如圖6 所示），研制固相微萃取裝置，結(jié)合HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測水樣和尿液中的FQs，檢測限可達0.1～10g/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%。

Turiel 等[56]以CIP 為模板，通過沉淀聚合制備MIPs，作為選擇性吸附劑檢測分析土壤樣品中的FQs。在最優(yōu)條件下，成功檢測土壤樣品中的5 種FQs，回收率可達87.90%～103.50%。Zhu 等[57]以CIP為模板分子，使用離子液體功能單體，在水中合成了一種新型的仿生材料（合成路線如圖7 所示），已成功應(yīng)用于水、土壤和豬肉樣品中痕量CIP的分離和富集，回收率為87.33%～102.50%。

仿生傳感器具有靈敏度高、線性范圍寬和檢測限低的優(yōu)點，常用于環(huán)境中藥物的殘留檢測。Liu等[58]采用沉淀聚合法，以NFX為模板分子，合成印跡仿生抗體，進一步功能化修飾，制備出快速和超靈敏檢測NFX的電化學(xué)傳感器（構(gòu)建方法如圖8所示），可用于制劑和生物樣品中靶物質(zhì)的快速檢測。在最優(yōu)條件下，該傳感器的線性檢測范圍為0.003～3.125μmol/L，檢 測 限 為1.58nmol/L。Liu等[59]利用高熒光碳點與CdTe 量子點結(jié)合，構(gòu)建了一種多功能分子印跡比率熒光傳感器，已成功應(yīng)用于人尿樣中CIP 的檢測，線性范圍為0～60nmol/L，檢測限為0.0127nmol/L。

圖5 環(huán)丙沙星納米復(fù)合光傳感器的構(gòu)建原理［53］

圖6 制備分子印跡中空纖維束的兩步聚合工藝方案［55］

圖7 環(huán)丙沙星仿生識別材料合成示意圖［57］

圖8 分子印跡電化學(xué)傳感器的構(gòu)建［58］

3 結(jié)語與展望

分子印跡仿生抗體顯示出良好的選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性，已廣泛應(yīng)用于食品和環(huán)境安全領(lǐng)域。然而，目前喹諾酮類藥物印跡仿生抗體在實際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，尚難以完全替代傳統(tǒng)檢測方法。首先，合成的印跡仿生抗體過程中模板分子與聚合物的作用力較弱（主要靠氫鍵、靜電、疏水及范德華力等）,導(dǎo)致印跡容量和效應(yīng)較低，嚴(yán)重限制了其向商業(yè)化規(guī)模發(fā)展；其次，對分子印跡過程及識別過程的機理、結(jié)合位點的作用機理、仿生抗體的結(jié)構(gòu)和傳質(zhì)機理等方面的研究仍不透徹；此外，大多數(shù)分子印跡的合成和識別基本上都限制在有機相中，研究如何能夠用特殊的分子間作用力在水溶液或極性溶劑中進行分子印跡和識別仍是目前難以解決的問題。

為解決以上問題，今后喹諾酮類藥物印跡仿生抗體的研究應(yīng)主要集中在以下幾方面：尋找一些能夠形成更強作用鍵的功能單體，或者將幾種作用力偶合起來，增強印跡過程中的鍵合作用力；從分子水平上更好地理解和研究分子識別過程，制備出性質(zhì)與天然抗體相類似的均質(zhì)性結(jié)合位點的新型分子印跡仿生抗體；通過優(yōu)化分子印跡仿生抗體的合成條件，實現(xiàn)從有機相到水相的轉(zhuǎn)變，使分子印跡仿生抗體能夠代替生物抗體，構(gòu)建和開發(fā)高性能識別模式，建立高保真仿生分析方法。

總之，從成本、生態(tài)和環(huán)境保護的角度來看，合成或?qū)ふ腋m宜的功能單體和溶劑，開發(fā)更便捷的合成方法及構(gòu)建高性能仿生識別模式，是新型喹諾酮類藥物印跡仿生抗體研制及應(yīng)用的重要發(fā)展方向。