孫瑩霄，廖 赟，歐陽(yáng)麗萍，宋文剛

(1.北華大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 藥學(xué)部，上海 200336)

骨缺損人工植入材料是在出現(xiàn)不能自愈的骨缺損問(wèn)題后植入患處起修復(fù)、填充、固定和支撐等作用的醫(yī)用材料[1].目前，科研人員一直致力于開發(fā)具有能夠滿足細(xì)胞及血管生長(zhǎng)要求的人工植入材料，不斷提高其生物性能[2].高分子材料在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用廣泛[3]，聚醚醚酮(PEEK)是一種高分子半晶體聚合物[4]，其彈性模量介于3～4 GPa之間，相較于傳統(tǒng)鈦合金更接近骨組織[5-6].PEEK具有良好的耐腐蝕性、射線可透過(guò)性，對(duì)影像學(xué)評(píng)估影響較小[7-8].課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)濃硫酸處理后的磺化PEEK具有三維孔道結(jié)構(gòu)，對(duì)PEEK材料的抗菌和成骨性能均有所改善，需進(jìn)一步進(jìn)行臨床前動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)[9].目前，以長(zhǎng)骨為植入位置的骨缺損模型研究較少，操作難度較大，提供一種用來(lái)評(píng)價(jià)植入材料骨修復(fù)性能的小鼠股骨遠(yuǎn)端骨缺損模型.

骨損傷修復(fù)涉及一系列復(fù)雜的生理和病理過(guò)程.骨骼是高度血管化的器官，骨修復(fù)與血管生成密不可分.2014年Ralf Adams團(tuán)隊(duì)[10]在Natrue發(fā)文提出，骨組織的血管系統(tǒng)存在兩種血管亞型，即H型和L型，并證實(shí)H型血管(CD31hiendomucinhivessel，HV)與機(jī)體成骨功能存在明顯的正相關(guān).HV具有獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能特性，主要分布在脛骨干骺端和股骨內(nèi)膜附近的小梁骨周圍[11]，而股骨遠(yuǎn)端與脛骨相比具有更大的直徑，更有利于作為植入位置評(píng)價(jià)植入材料的生物相容性.

選用具有抗菌性且透射線性的磺化PEEK做為植入材料，應(yīng)用C57BL/6J雌性小鼠為模型動(dòng)物，以H型血管豐富的股骨遠(yuǎn)端為植入部位，構(gòu)建一種適用于評(píng)價(jià)植入材料生物性能的股骨遠(yuǎn)端骨缺損植入模型，為新型植入材料的開發(fā)及應(yīng)用提供合適的動(dòng)物模型.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由上海南方模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供雌性7周齡C57BL/6J小鼠3只，體重為18～20 g，小鼠自由進(jìn)食并觀察一周，無(wú)異常后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

電子天平(上海精天FA200)，micro-CT成像儀(Scanco viva40，瑞士)，電鉆(Dremel Sty-LusTM 1100-01，美國(guó))，掃描電子顯微鏡(FE-SEM，Hitachi S-4800，Japan)，磁力攪拌器，聚醚醚酮(江蘇君華)，戊巴比妥鈉(北京普博斯生物)，75%乙醇，生理鹽水(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司)，注射用青霉素鈉(華北制藥).

1.3 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

使用濃硫酸對(duì)PEEK進(jìn)行磺化處理，具體步驟如下：在燒杯中加入適量濃硫酸，并置于磁力攪拌器上.將PEEK棒材(直徑1 mm、長(zhǎng)度5 mm)放入燒杯，打開磁力攪拌器調(diào)節(jié)至合適轉(zhuǎn)速(確保PEEK在磺化過(guò)程中不黏連)，室溫下處理10 min.用超純水清洗磺化后的材料3遍，晾干備用.將磺化聚醚醚酮置于容積為200 mL的反應(yīng)釜中，加入70 mL超純水，120 ℃水熱處理4 h.水熱處理后，磺化聚醚醚酮取出并用超純水清洗3遍，晾干備用.植入前，使用酒精滅菌24 h后置于無(wú)菌器皿內(nèi)備用.

1.4 植入模型的構(gòu)建

手術(shù)器械消毒：手術(shù)用鑷子，剪刀，持針器，鉆頭，等手術(shù)器械高溫消毒2 h后置于無(wú)菌器皿內(nèi)備用.麻醉：配制1%的戊巴比妥鈉備用.用天平稱量小鼠體重，并按20 mg/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠.備皮：用剃毛器剃除小鼠手術(shù)部位及周邊的被毛；用75%的酒精棉球和碘伏分別擦拭手術(shù)部位及周邊皮膚3次.暴露股骨遠(yuǎn)端：將小鼠截石位屈膝置于手術(shù)操作臺(tái)上.沿股骨方向剪開膝關(guān)節(jié)外皮膚，并適當(dāng)撐開.在膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)斜上方將股三頭肌向外側(cè)翻開暴露股骨遠(yuǎn)端.開孔：先用低速骨鉆在股骨遠(yuǎn)端髁間鉆直徑0.4 mm的圓孔缺損，更換0.8 mm鉆頭進(jìn)一步將圓孔擴(kuò)大至1.0 mm直徑.植入材料：將滅菌后的磺化聚醚醚酮材料由上述圓孔小心地置入股骨骨髓腔內(nèi).消毒縫合：無(wú)菌生理鹽水沖洗傷口，滴加青霉素鈉溶液(8萬(wàn)單位)消毒，縫合傷口.小鼠給予充足的食物和水喂養(yǎng).術(shù)后肌肉注射青霉素8萬(wàn)單位/d，連續(xù)3 d.

1.5 觀察項(xiàng)目與檢測(cè)方法

術(shù)后觀察小鼠健康情況和后肢膝關(guān)節(jié)活動(dòng)情況.2周后，處死小鼠，并分離小鼠股骨，觀察小鼠股骨遠(yuǎn)端外觀.采用micro-CT成像技術(shù)分析小鼠股骨缺損模型：使用三維重建觀察材料的植入位置和骨小梁微結(jié)構(gòu)的改變，并分析計(jì)算骨小梁參數(shù).

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 磺化PEEK掃描電鏡的形貌表征

如圖1左所示，在掃描電鏡下觀察PEEK表面平坦致密無(wú)孔洞；圖1右所示磺化PEEK表面呈均勻疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).掃描電鏡結(jié)果表明應(yīng)用濃硫酸成功將PEEK磺化.

圖1 材料表面形貌

2.2 股骨遠(yuǎn)端植入模型的構(gòu)建

小鼠截石位屈膝在膝關(guān)節(jié)處沿股骨方向剪開皮膚，皮膚開口長(zhǎng)度約0.5 cm，如圖2a所示，白色長(zhǎng)條組織為髕韌帶.由膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)向外側(cè)翻開肌肉見股骨遠(yuǎn)端，股骨遠(yuǎn)端兩側(cè)突起結(jié)構(gòu)為股骨髁,見圖2b中黑色箭頭所示.如圖2c～d所示，兩側(cè)骨股髁中點(diǎn)為圓點(diǎn)用電鉆鉆開1 mm直徑的圓孔缺損，圓孔缺損在股骨遠(yuǎn)端中央位置，除股骨位置以外未造成其他缺損.如圖2e所示，將材料置入圓孔內(nèi)，復(fù)位側(cè)翻的股三頭肌及髕骨，如圖2f所示，小鼠膝關(guān)節(jié)無(wú)異常錯(cuò)位現(xiàn)象，如圖2g所示，關(guān)閉小鼠創(chuàng)口后，小鼠創(chuàng)面無(wú)出血.

(a)剪開皮膚

(b)暴露股骨遠(yuǎn)端

(c)鉆孔

(d)鉆孔

(e)植入材料

(f)復(fù)位

(g)關(guān)閉創(chuàng)口圖2 小鼠股骨遠(yuǎn)端骨缺損模型的構(gòu)建

2.3 小鼠術(shù)后活動(dòng)情況

在小鼠股骨遠(yuǎn)端造成開放性創(chuàng)傷，若造成小鼠腿部活動(dòng)受限，將影響小鼠正常飲食，造成植入材料的體內(nèi)評(píng)估出現(xiàn)誤差.觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠行單側(cè)股骨遠(yuǎn)端植入模型手術(shù)后小鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)正常，小鼠飲食行動(dòng)均正常，所有小鼠存活至取材.

2.4 鼠股骨骨缺損模型外觀形態(tài)

植入2周后，將小鼠處死并分離取出股骨.如圖3所示，右側(cè)為股骨遠(yuǎn)端，黑框內(nèi)所示為植入材料位置，植入?yún)^(qū)域的顏色較淺.小鼠股骨骨干完整，股骨遠(yuǎn)端組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯缺損，植入材料位于股骨遠(yuǎn)端骨髓腔內(nèi).

圖3 股骨骨缺損模型外觀照片

2.5 micro-CT掃描三維骨結(jié)構(gòu)

micro-CT掃描結(jié)果如圖4所示.

圖4 股骨遠(yuǎn)端micro-CT三維圖片

圖4右顯示，植入材料位于股骨遠(yuǎn)端至小鼠股骨骨髓腔內(nèi)，兩組骨小梁結(jié)構(gòu)相對(duì)比，圖4左圖像顯示對(duì)照組股骨不規(guī)則細(xì)絲狀的骨小梁結(jié)構(gòu)，模型組股骨內(nèi)有隱約可見的骨小梁結(jié)構(gòu).

2.6 骨小梁分析

骨小梁數(shù)量分析結(jié)果如圖5所示，模型組小鼠骨小梁數(shù)量較對(duì)照組骨小梁數(shù)量顯著性降低(t檢驗(yàn)，P<0.05).骨小梁體積分析結(jié)果如圖6所示，模型組骨小梁體積與對(duì)照組骨小梁體積比較，模型組骨小梁體積低于對(duì)照組(t檢驗(yàn)，P<0.001).

圖5 骨小梁數(shù)量

圖6 骨小梁體積

3 結(jié) 論

理論上大型動(dòng)物如犬、豬、羊等與人體骨組織結(jié)構(gòu)類似，是研究骨骼愈合機(jī)制的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.然而，大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本高，并且其骨組織愈合能力慢，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng).常用來(lái)構(gòu)建骨缺損模型的小型動(dòng)物主要有小鼠、大鼠、兔等.鼠科動(dòng)物不僅具有較強(qiáng)的抗感染能力，且圍手術(shù)期易于管理[12]，因此鼠科動(dòng)物常被用來(lái)研究材料對(duì)骨缺損的修復(fù)能力.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)性的因素.為避免生長(zhǎng)情況對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，本實(shí)驗(yàn)選用8周齡雌性C57BL /6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.

動(dòng)物模型是醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的支撐條件，構(gòu)建合適的動(dòng)物模型是準(zhǔn)確評(píng)價(jià)植入材料生物相容性的關(guān)鍵[13].評(píng)價(jià)植入材料的體內(nèi)生物性能常選取的模型部位主要有牙槽骨、顱骨、脛骨、椎骨、股骨等[14-15].本實(shí)驗(yàn)選擇股骨遠(yuǎn)端作為損傷部位主要有兩方面原因：小鼠顱骨、脛骨、牙槽骨等部位手術(shù)操作困難；研究發(fā)現(xiàn)，H血管在股骨遠(yuǎn)端含量豐富[6]，因此選取股骨遠(yuǎn)端作為損傷植入部位不僅利于材料對(duì)骨影響的評(píng)價(jià)，而且可對(duì)骨特異性H血管進(jìn)行分析.

PEEK具有耐腐蝕，彈性模量與骨相近的特點(diǎn)已作為醫(yī)用材料應(yīng)用于臨床[16-17].然而，PEEK的生物相融性、骨整合能力等方面仍有待進(jìn)一步提高.研究發(fā)現(xiàn)濃硫酸處理后的磺化PEEK具有三維孔道結(jié)構(gòu)[18-19]，對(duì)PEEK材料的抗菌和成骨性能均有所改善[7].其表面的三維孔道結(jié)構(gòu)又可以作為促成骨藥物載體進(jìn)一步提高生物活性及成骨性能[20-21]，需開展有效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為磺化PEEK的臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ).

為避免開孔造成股骨斷裂，采用多尺寸鉆頭循序漸進(jìn)的方式進(jìn)行開孔.先用0.4 mm直徑的鉆頭在股骨遠(yuǎn)端中間位置初步鉆一個(gè)圓孔缺損，再使用0.8 mm鉆頭擴(kuò)大到1.0 mm.術(shù)后觀察顯示，小鼠活動(dòng)自由未發(fā)生感染；micro-CT掃描成像分析結(jié)果顯示植入材料位于股骨骨髓腔內(nèi)，模型組小鼠骨小梁數(shù)量及骨小梁體積較對(duì)照組有明顯差異.上述結(jié)果表明使用多尺寸鉆頭循序漸進(jìn)的方式進(jìn)行開孔可成功構(gòu)建小鼠股骨遠(yuǎn)端骨缺損模型且不會(huì)造成股骨斷裂.

綜上所述：使用多尺寸鉆頭循序漸進(jìn)的方式進(jìn)行開孔可在8周齡雌性C57BL /6J小鼠股骨遠(yuǎn)端成功構(gòu)建骨缺損.植入磺化PEEK棒，小鼠股骨未發(fā)生骨折現(xiàn)象，術(shù)后小鼠活動(dòng)飲食均未受影響，說(shuō)明股骨遠(yuǎn)端骨缺損模型構(gòu)建成功.