楊艷俊，楊秀東，王亞紅

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院 ，吉林 吉林 132000)

景天三七(SedumaizoomL.)為景天科景天屬多年生草本植物的全草，又名土三七、土人參、馬三七、養(yǎng)心草等，分布廣泛，在我國(guó)華北、東北、西北及長(zhǎng)江流域山地、林緣、林下、河岸及陰濕草地均有生長(zhǎng)[1-2].景天三七味甘、性平、微酸，肝經(jīng)、歸心，有止血、活血化瘀等功效，臨床用于治療吐血、便血、跌打損傷、清熱涼血、安神補(bǔ)血、外傷出血[3]，還用于治療神經(jīng)衰弱、失眠、煩躁不安[4]等癥狀.現(xiàn)代藥理研究表明，其含有生物堿、多種酚酸、谷甾醇、黃酮類(lèi)[5-6]、齊墩果酸、景天庚糖及多種揮發(fā)油[7]等藥用成分，且無(wú)毒副作用，景天三七還具有良好的抗氧化作用[8].景天三七酚酸化合物主要成分為沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、沒(méi)食子酸甲酯等[9].酚酸類(lèi)化合物具有抗炎、抗病毒、抗癌、凝血、抗氧化以及調(diào)節(jié)生理活性等作用.景天三七還可以加工成保健食品、藥品、茶飲料[10]等產(chǎn)品.景天三七抗氧化能力較強(qiáng)，陳惠卿的土三七總酚酸抗氧化活性的研究表明在3個(gè)不同的抗氧化活性評(píng)價(jià)模型中，土三七總酚酸呈現(xiàn)了不同的抗氧化活性[11].提取酚酸的方法主要有水浸提法、有機(jī)溶劑法、超聲輔助法[12]、堿液提取法、微波輔助提取法[13-14]和超臨界CO2萃取法[15]等.本實(shí)驗(yàn)考察的是超聲輔助法提取景天三七總酚酸.

1 材料與方法

1.1 材料

沒(méi)食子酸，HPLC≥98%，DPPH≥98%，ABTS(≥98%)，維生素C(≥99%)均來(lái)自上海伊卡生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、三氯化鐵，濃鹽酸，鐵氰化鉀，十二烷基硫酸鈉，過(guò)硫酸鉀均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

RT-08型粉碎機(jī)，北京開(kāi)創(chuàng)同和發(fā)展有限公司；TD6001C型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；FA2204N型分析天平，上海菁海儀器有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；752N型紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；KQ-250DE型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品及供試品溶液配制

精密稱取5 mg沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品加入到250 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇至刻度線，配成濃度為20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

精密稱取2 g景天三七粉末于100 mL燒瓶中，加入70%乙醇溶液浸泡1 h，在一定條件下的超聲清洗器中提取，提取液減壓抽濾，定容到50 mL容量瓶中，用1 mL移液管吸取1 mL提取液置于50 mL容量瓶中，定容，為待測(cè)溶液.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究得知，精密度實(shí)驗(yàn)RSD=0.98%，重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD=2.4%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在20～45 min時(shí)最穩(wěn)定.

精密吸取6份“1.3.1”項(xiàng)下的已知總酚酸含量的提取液，按“1.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，總酚酸量記為G1，每份加入總酚酸量記為G2對(duì)照品溶液，測(cè)定混合液的吸光度值，總酚酸量記為G3，加樣回收率的計(jì)算式為(G3- G1)/G2，6份數(shù)據(jù)平均，并計(jì)算偏差.

1.3.3 供試品含量測(cè)定及提取率計(jì)算

精密移取1 mL已配制好的供試品溶液，置于25 mL容量瓶中，按1.3.2方法測(cè)吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總酚酸的提取率.提取率計(jì)算公式：

(1)

其中W為總酚酸的提取率，%；c為紫外分光光度計(jì)測(cè)得的吸光度按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的總酚酸的濃度，mg/mL；V為測(cè)吸光度時(shí)供試品溶液的體積，mL；m為藥材景天三七的質(zhì)量，g.

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1料液比對(duì)總酚酸提取率的影響

1.3.4.2 溫度對(duì)總酚酸提取率的影響

1.3.4.3 提取時(shí)間對(duì)總酚酸提取率的影響

1.3.4.4 乙醇濃度對(duì)總酚酸率的影響

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn).考慮乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)景天三七總酚酸提取的影響，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，按照L9(34)正交設(shè)計(jì)表來(lái)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證提取的最佳條件，如表1所示.

表1 總酚酸提取率的正交實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)

1.3.6 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

量取不同濃度景天三七提取液加入DPPH溶液[16]，在517 nm處測(cè)定吸光度為A樣品.將不同濃度的供試品溶液加入測(cè)定吸光度記為A對(duì)照.用蒸餾水代替供試品溶液，加入DPPH溶液，在517 nm處測(cè)定吸光度記為A空白.用同樣條件測(cè)定Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力.DPPH清除率清除率%=(A空白-A樣品+A對(duì)照)/A空白×100%.

1.3.6.2 對(duì)ABTS自由基陽(yáng)離子的清除

將配制的ABTS自由基陽(yáng)離子溶液[17]在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)量吸光度并記為A空白.不同濃度的供試品溶液測(cè)其吸光度值A(chǔ).用Vc作為對(duì)照，將Vc配成不同濃度按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得Vc對(duì)ABTS自由基陽(yáng)離子的清除率.ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的清除率%=(A空白-A)/A空白×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，平均加樣回收率為99.22%，RSD為1.71%，表明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較好.

表2 回收率結(jié)果

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)總酚酸提取率的影響

不同料液比的總酚酸提取率分別為2.50%、3.30%、3.28%、3.27%、3.29%.

料液比圖1 料液比對(duì)總酚酸提取率的影響

2.2.2 溫度對(duì)總酚酸提取率的影響

不同提取溫度的總酚酸含量分別為2.55%、2.76%、3.19%、3.10%、2.96%.由圖2可知隨著溫度的升高，總酚酸的提取率逐漸增大.當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，總酚酸的提取率達(dá)到最大，最適宜提取溫度為50 ℃.

溫度/℃圖2 溫度對(duì)總酚酸提取率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總酚酸提取率的影響

提取時(shí)間的總酚酸提取率分別為2.55%、2.89%、3.00%、3.19%、3.10%.

由圖3可知隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，總酚酸的提取率逐漸增大.當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，提取率最高，選擇提取時(shí)間為60 min最為合適.

時(shí)間/min圖3 提取時(shí)間對(duì)總酚酸提取率的影響

2.2.4 乙醇濃度對(duì)總酚酸提取率的影響

不同乙醇濃度的總酚酸提取率分別為2.68%、2.96%、3.27%、3.35%、2.68%.

由圖4可知，隨著乙醇濃度的增大，總酚酸的提取率也不斷提高.當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，提取率達(dá)到最高，應(yīng)該在此濃度下溶媒的極性與所提取的總酚酸相當(dāng)，所以提取效果最好，再繼續(xù)提高乙醇濃度時(shí)，溶媒極性下降后導(dǎo)致總酚酸的提取率也不斷隨之下降，乙醇濃度選擇為70%時(shí)最為合適.

乙醇濃度/%圖4 乙醇濃度對(duì)總酚酸提取率的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示.由表可知，RT>Rt>RE>Rc，即在景天三七總酚酸的提取工藝中，影響因素最大的是提取溫度，其次為提取時(shí)間、提取料液比，乙醇濃度最小.以最小誤差項(xiàng)作為來(lái)源項(xiàng)，其中提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比的影響差異顯著，乙醇濃度對(duì)提取影響較小.由于c因素水平離差平方和較小，證明c因素是由于實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致因素水平數(shù)值的變化，故將c因素作為誤差項(xiàng).

表3 總酚酸提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 方差來(lái)源結(jié)果分析

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.5 抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.5.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

景天三七提取液對(duì)DPPH自由基清除率分別為：62.73%、68.77%、78.60%、84.56%、90.60%、96.89%，Vc對(duì)DPPH自由基清除率分別為：66.48%、80.24%、91.07%、94.62%、96.99%、98.82%.

由圖5可知，景天三七總酚酸提取液對(duì)DPPH自由基清除能力隨著濃度的增大而增大，與Vc相比略低，濃度為0.6 mg·mL-1時(shí)清除率能達(dá)到96.89%.

溶液濃度/(mg·mL-1)圖5 景天三七提取液與Vc溶液對(duì)DPPH自由基清除能力對(duì)比

2.5.2 對(duì)ABTS自由基的清除能力及結(jié)果分析

景天三七提取液對(duì)ABTS自由基清除率分別為：37.55%、61.17%、64.30%、72.20%、83.07%、97.01%，Vc對(duì)ABTS自由基清除率分別為：56.70%、62.39%、65.53%、78.06%、85.74%、97.29%.

由圖6可知，景天三七提取液對(duì)ABTS自由基清除率隨著提取液濃度的增加而增大，在濃度為0.6 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS的清除率達(dá)到97.01%，與Vc相接近.

溶液濃度/(mg·mL-1)圖6 景天三七提取液與Vc溶液對(duì)ABTS自由基清除能力對(duì)比

3 結(jié) 論

景天三七提取溶液對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力與Vc的對(duì)比可以得出，景天三七提取液與Vc溶液具有相近的體外抗氧化活性.