曾麗娜

【摘要】 目的：檢測(cè)7-二氟亞甲基-5，4-二甲氧基染料木黃酮（DFOG）對(duì)H2O2 氧化應(yīng)激人子宮螺旋動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUSAEC）增殖凋亡的影響。方法：體外培養(yǎng)HUSAEC細(xì)胞，在加入H2O2 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)前30 min，分別添加不同濃度DFOG（2、4、8 ?mol/L）進(jìn)行預(yù)孵，MTT檢測(cè)DFOG對(duì)H2O2 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，F(xiàn)CM檢測(cè)DFOG對(duì)H2O2 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：與H2O2組比較，DFOG各組明顯減輕了H2O2對(duì)HUSAEC細(xì)胞增殖的抑制作用，減少H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HUSAEC細(xì)胞的凋亡（P<0.05），呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)論：DFOG對(duì)H2O2 氧化應(yīng)激HUSAEC細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖及抑制凋亡作用，提示DFOG可能成為妊娠期高血壓疾病治療的新型藥物。

【關(guān)鍵詞】 妊娠期高血壓疾病 7-二氟亞甲基-5，4-二甲氧基染料木黃酮 增殖 凋亡

Effects of 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy Genistein on Endothelial Cells of Human Uterine Spiral Artery Induced by Oxidative Stress/ZENG Lina. //Medical Innovation of China， 2020， 17（10）： -160

[Abstract] Objective： To determine the effect of 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein （DFOG） on proliferation and apoptosis of human uterine spiral artery endothelial cells （HUSAEC） induced by H2O2 oxidative stress. Method： HUSAEC cells were cultured in vitro， 30 minutes before the induction of H2O2 oxidative stress， different concentrations of DFOG （2， 4， 8 μmol/L） were added for pre incubation. MTT was used to detect the effect of DFOG on the proliferation of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress， FCM was used to detect the effect of DFOG on the apoptosis of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress. Result： Compared with H2O2 group， DFOG group significantly reduced the inhibition of H2O2 on the proliferation of HUSAEC cells， and reduced the apoptosis of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress （P<0.05）， which was concentration and time-dependent. Conclusion： DFOG can significantly promote proliferation and inhibit apoptosis of H2O2 oxidative stress HUSAEC cells， suggesting that DFOG may be a new drug for the treatment of hypertension during pregnancy.

[Key words] Hypertension during pregnancy 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein Proliferation Apoptosis

First-authors address： The Affiliated Hospital of Putian University， Putian 351100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.10.039

妊娠期高血壓疾?。╤ypertensive disorders complicating pregnancy， HDCP）是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，發(fā)生率5%～12%，是一組嚴(yán)重影響母嬰健康的疾病，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因[1]。目前HDCP病因?qū)W主要集中在子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄不足、炎癥免疫過(guò)度激活、血管內(nèi)皮受損、遺傳因素、營(yíng)養(yǎng)缺乏、胰島素抵抗等方面，其中子宮螺旋小動(dòng)脈內(nèi)皮損傷是研究HDCP的熱點(diǎn)之一[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是子癇前期的基本病理變化，可使擴(kuò)血管物質(zhì)，如一氧化氮、前列環(huán)素I2合成減少，而縮血管物質(zhì)如內(nèi)皮素、血栓素A2等合成增加，從而促進(jìn)血管痙攣;另外血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷還可以激活血小板和凝血因子，加重子癇前期高凝狀態(tài)[3]。引起子癇前期血管內(nèi)皮損傷的因素很多，主要為氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子、極低密度脂蛋白等[4]。研究表明氧化應(yīng)激在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，H2O2是活性氧家族中重要的一員，可以體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;紫外線等離子射線作用于細(xì)胞后，可誘使細(xì)胞產(chǎn)生H2O2，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。7-二氟亞甲基-5，4-二甲氧基染料木黃酮（7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein， DFOG）是一種從豆類(lèi)植物提取的異黃酮化合物衍生物，具有抗氧化、抑凋亡、抗腫瘤以及類(lèi)雌激素等作用[6-7]。2018年5月-2019年4月本研究擬探討DFOG對(duì)體外培養(yǎng)H2O2氧化應(yīng)激損傷的人子宮螺旋動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUSAEC）的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HUSAEC購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;DFOG由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系合成;H2O2（恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）;DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）;胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）;MTT（美國(guó)Sigma公司）;二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 HUSAEC用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)受試物的不同分為A、B、C、D、E組，A組為正常對(duì)照組（受試物為NS）;B組受試物H2O2（H2O2終濃度為1 mmol/L）;C、D、E各組在加入1 mmol/L H2O2前30 min，分別添加DFOG進(jìn)行預(yù)孵，使DFOG終濃度分別為2、4、8 ?mol/L。即：C組受試物為DFOG 2 ?mol/L+1 mmol/L H2O2;D組受試物為DFOG 4 ?mol/L+1 mmol/L H2O2;E組受試物為DFOG 8 ?mol/L+1 mmol/L H2O2。

1.2.2 MTT測(cè)定HUSAEC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUSAEC細(xì)胞，分別加入A、B、C、D、E組受試物，5組均予以培養(yǎng)24、48和72 h，改用5 mg/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后移去MTT混懸液，再用100 ?L DMSO溶解晶體，用酶標(biāo)儀（ELX-800）570 nm波段檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值）×100%，采用改良寇氏法求出IC50值[8]。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUSAEC細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUSAEC細(xì)胞，分別加入A、B、C、D、E組受試物，5組均予以培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用冰PBS洗2遍，用4 ℃的70%的乙醇固定24 h后，碘化丙啶4 ℃避光染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同受試物作用下HUSAEC細(xì)胞凋亡率[9]。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo) （1）分析DFOG對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的影響;（2）分析DFOG對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞凋亡的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間均數(shù)比較，采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，多組間均數(shù)組間兩兩比較采用SNK法（q檢驗(yàn)）進(jìn)行單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DFOG對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的影響 B組HUSAEC細(xì)胞24、48、

72 h細(xì)胞增殖活性分別為（87.51±2.93）%、（70.24±3.79）%和（41.39±5.26）%，表明H2O2可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。C組HUSAEC細(xì)胞24、48、72 h細(xì)胞增殖活性分別為（94.30±2.04）%、（81.09±3.25）%和（75.57±3.52）%;D組HUSAEC細(xì)胞24、48、72 h細(xì)胞增殖活性分別為（96.21±1.87）%、（84.73±2.98）%和（80.94±3.39）%;E組HUSAEC細(xì)胞24、48、72 h細(xì)胞增殖活性分別為（97.12±1.63）%、（88.31±2.87）%和（84.53±3.12）%。隨著DFOG濃度的增加以及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸改善H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HUSAEC細(xì)胞的增殖抑制，其中E組改善效果最明顯。24、48、72 h，C、D、E組的細(xì)胞增殖活性均高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 DFOG對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的影響

2.2 DFOG對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞凋亡的影響 48 h后，A、B、C、D、E組細(xì)胞凋亡率分別為（4.96±2.17）%、（51.64±3.50）%、（42.33±5.16）%、（31.68±4.90）%、（20.44±3.19）%，C、D、E組的細(xì)胞凋亡率均低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;C、D、E各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示作用呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖2。

3 討論

黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于各種植物中，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，通過(guò)與靶蛋白的結(jié)合，對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，是其機(jī)制之一，有研究表明，黃酮類(lèi)化合物可以調(diào)節(jié)動(dòng)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10-11]。染料木黃酮又名金雀異黃素、染料木苷元，化學(xué)名為4，5，7-三羥基異黃酮，分子式為C15H10O5（相對(duì)分子量為270.2 g/mol），是大豆異黃酮的主要成分。以染色木黃酮為先導(dǎo)化合物，在C-7位引入二氟亞甲基、C-5，4位引入甲氧基，定向化學(xué)改造得到的DFOG具有更強(qiáng)的拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的活性[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)H2O2氧化應(yīng)激損傷的HUSAEC細(xì)胞，觀察DFOG對(duì)HUSAEC細(xì)胞的增殖抑制活性及細(xì)胞凋亡效用，并進(jìn)一步探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。

Marinova等[13]研究表明DFOG體外通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)蛋白而對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤U0126細(xì)胞有增殖抑制的作用，而對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性很小。Hernández等[14]研究表明DFOG通過(guò)調(diào)節(jié)5-HI的表達(dá)，增強(qiáng)腦細(xì)胞抗氧化作用，提高阿爾茨海默病的臨床效果。徐叢榮等[15]采用MTT比色法觀察到染料木黃酮能明顯抑制體外培養(yǎng)的宮頸Hela細(xì)胞的增殖，對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用具有劑量依賴(lài)性，隨著染料木黃酮藥物濃度的增大，其對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用也逐漸增強(qiáng)。2019年姜雪梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮通過(guò)抑制ERK及JNK的活化從而抑制人非小細(xì)胞肺癌PC14細(xì)胞的增殖。目前DFOG對(duì)HUSAEC氧化應(yīng)激損傷作用方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少。胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤(pán)的主要細(xì)胞類(lèi)型之一，滋養(yǎng)細(xì)胞的功能障礙可以導(dǎo)致活性氮和活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而激活母體血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起子癇前期相關(guān)的多系統(tǒng)功能障礙[17]。子癇前期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性下降，其中子癇前期胎盤(pán)滋養(yǎng)層谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽氧化還原比（GRR）和總抗氧化能力（TAC）水平明顯降低，染料木黃酮孵育子癇前期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞后，GPx、GRR和TAC水平明顯升高，提示染料木黃酮可以改善子癇前期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平[17]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUSAEC細(xì)胞，驗(yàn)證DFOG可以改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷的HUSAEC細(xì)胞生長(zhǎng)，降低細(xì)胞凋亡率。文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道DFOG對(duì)氧化誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附及黏附分子E選擇素、細(xì)胞間黏附分子1的釋放有明顯抑制作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)核因子κB和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2的表達(dá)有關(guān);DFOG對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低活性氧的生成，下調(diào)Caspase-3的表達(dá)，從而拮抗H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，DFOG對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的HUSAEC細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖及抑制凋亡作用，本課題組將進(jìn)一步研究其可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為HDCP的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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（收稿日期：2019-08-28） （本文編輯：姬思雨）