馮慰蓮， 黃仁偉， 王曉藝， 嚴悅溶， 伍嘉韻， 陳彩霞， 黎鋒， 張錦，嚴勵， 徐明彤

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的分化型甲狀腺癌，其詳盡機制尚未闡明。近年認為慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，趨化因子可由腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞分泌，誘導不同的免疫細胞亞群遷移至腫瘤部位，或直接作用于腫瘤細胞和血管內皮細胞，調節(jié)腫瘤免疫反應，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。CXC趨化因子配體10（chemokine（C-X-C motif）ligand 10，CXCL10）是非谷氨酸-亮氨酸-精氨酸序列（glutamic acidleueinerginine，ELR）CXC趨化因子的一員，研究顯示與慢性炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病相關［1］，其與PTC的發(fā)生和進展的相關性仍待探討。本研究旨在通過檢測CXCL10在PTC組織及良性甲狀腺疾病甲狀腺組織中的表達，探討CXCL10表達水平與PTC患病及侵襲轉移風險的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2008年1月至2013年3月于中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院行首次甲狀腺手術，術后病理確診為甲狀腺乳頭狀癌者105例。入組標準為：2008年1月至2013年3月于本院行首次甲狀腺手術，術后病理確診為PTC。排除標準為：①臨床資料缺失；②超聲資料缺失；③無法進行TNM分期及AJCC分期者；④合并其他免疫性疾病者；⑤合并其他惡性腫瘤者；⑥合并其他嚴重疾病者；⑦石蠟切片缺失者。甲狀腺良性疾病結節(jié)性甲狀腺腫（nodular goiter，NG）和慢性淋巴細胞性甲狀腺炎（chronic lymphocytic thyroiditis，CLT）各20例。本研究已獲得所有患者的書面知情同意和孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 資料收集

收集上述PTC、NG、CLT患者的臨床和病理資料。臨床資料包括年齡、性別、術前超聲資料，病理資料包括病理診斷、TNM分期、AJCC分期。其中術前超聲資料包括病灶數(shù)量、大小，邊緣、形狀、回聲、實質性、均質性、內部鈣化、血流和頸部淋巴結大小、形狀、皮髓質分界，囊實性、鈣化。病理診斷由有經驗的病理醫(yī)生根據(jù)世界衛(wèi)生組織甲狀腺惡性腫瘤分類進行獨立判定。TNM及AJCC分期依據(jù)第七版美國抗癌聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌癥分期手冊。

1.3 免疫組化

免疫組化染色采用鏈霉親和素-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法，免疫組化試劑盒（GK500705）購自上?；蚩萍加邢薰尽Ｊ炃衅撓?、梯度水化，3%H2O2置于37℃恒溫箱中5～10 min以滅活內源性酶，將組織切片用檸檬酸緩沖液（PH6.0）進行微波抗原修復，滴加兔抗人CXCL10多克隆抗體（ab9807，Abcam），濃度為1.0 μg/mL（稀釋比1∶1000），4℃過夜，PBS沖洗，滴加通用型抗鼠兔IgG（1∶100），37℃恒溫箱中30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素輕度復染，流水沖洗。陰性對照為以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替I抗而其他處理不變的標本。

1.4 CXCL10的表達水平以免疫染色評分代表

CXCL10的表達水平以免疫染色評分代表。由兩名對臨床病理數(shù)據(jù)不知情的病理科醫(yī)生分別對標本的免疫反應性進行評估。每張玻片在高倍鏡下選擇至少10個具有代表性的視野進行評估。半定量評分由陽性細胞數(shù)百分比評分與染色強度評分組成，范圍為0～8分。陽性細胞數(shù)百分比評分標準如下：每個高倍鏡視野中對染色的癌細胞進行計數(shù)，有0～5%陽性表達細胞為0分，有6%～25%陽性表達為1分，26%～50%陽性表達為2分，51%～75%陽性表達為3分，76%～100%陽性表達為4分。染色強度評分的標準如下：不存在特異性染色為0分，可疑染色為1分，弱染色為2分，中等強度染色為3分，強染色為4分。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布資料經對數(shù)轉換后進行分析。統(tǒng)計學方法包括描述性統(tǒng)計、年齡分布采用平均數(shù)±標準差描述，t檢驗、方差分析及pearson相關分析。NG、CLT、PTC組間CXCL10表達水平的比較采用χ2檢驗、兩兩比較采用Bonferroni法。所有統(tǒng)計分析均采用雙側檢驗，P值＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 病例基本資料

本研究中PTC組包括男性20例，女性85例，年齡16～80歲，平均年齡47.3歲。病理分期Ⅰ期49例（46.7%）），Ⅱ期 6例（5.7%），Ⅲ期 33例（31.4%），Ⅳ期17例（16.2%）。NG組包括男性2例，女性18例，平均年齡50.3歲。CLT組包括男性2例，女性18例，平均年齡52.6歲。

2.2 CXCL10在PTC、NG、CLT組織中的表達

以CXCL10多克隆抗體為一抗，免疫組化可見CXCL10特異性染色存在于PTC細胞的胞漿，以及部分CLT組織中的濾泡立方上皮細胞的胞漿中（圖1），而NG組織中未見特異性染色。各組CXCL10染色評分有顯著差異（表1）。對各組染色評分兩兩比較，PTC組染色評分顯著高于NG組（P＜0.001）及CLT組（P＜0.001），CLT組染色評分顯著高于NG組（P＜0.001）。

表1 CXCL10在不同甲狀腺組織病理類型中的表達

2.3 CXCL10的表達與PTC臨床特征及術前超聲征象的相關性

表2 PTC患者的臨床病理資料及免疫組化染色評分（n=105）

PTC患者的臨床病理資料、超聲資料匯總見表2。CXCL10在不同年齡分組（＜45歲或≥45歲）及不同性別PTC中的表達無明顯差異。而有甲狀腺包膜外浸潤者的PTC組織中CXCL10表達顯著高于無包膜外浸潤者（P＜0.05）；有無頸部淋巴結轉移及遠處轉移者的CXCL10表達無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。根據(jù)AJCC分期，把免疫組化標本分為兩組：（Ⅰ期+Ⅱ期）組和（Ⅲ期+Ⅳ期）組，比較兩組最終染色評分，結果示（Ⅲ期+Ⅳ期）組的染色評分顯著高于（Ⅰ期+Ⅱ期）組（P＜0.05）（表2）。PTC中CXCL10的表達水平與術前超聲征象如病灶數(shù)量、大小、回聲、鈣化、血流情況、淋巴結大小、形狀、邊界、囊實性、鈣化均無顯著相關性（表2）。

3 討 論

CXCL10基因在正常細胞中常常呈低表達，在疾病狀態(tài)下主要由γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）共同刺激產生劑量依賴性的表達增加［2］。CXCL10通過與其受體CXCR3結合發(fā)揮作用，在誘導效應CD8+T細胞、Th1細胞和NK細胞向炎癥部位浸潤中起著關鍵的作用。既往研究顯示CXCL10的表達與多種自身免疫性疾病相關［3］，CLT患者血清中CXCL10的水平顯著高于正常人或結節(jié)性甲狀腺腫患者［4］。本研究在結節(jié)性甲狀腺腫（NG）組織中未檢測到CXCL10的表達，而在慢性淋巴細胞性甲狀腺炎（CLT）組織中有明顯的表達，這與既往的研究結果是一致的。CLT是一種以彌漫性淋巴細胞浸潤為特征的甲狀腺組織進行性損傷的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為明顯的甲狀腺功能減退。CXCL10在IFN-γ的刺激下，可由多種細胞如T淋巴細胞、單核細胞、成纖維細胞、甲狀腺細胞等分泌，誘導Th1細胞至炎癥部位分泌更多的IFN-γ和TNF-α，從而形成CXCL10分泌的反饋放大回路，導致炎癥的持續(xù)、組織損傷及自身免疫性抗體的產生［5］。CXCL10在CLT中的表達增加可能存在類似的機制。Rotondi M。等研究發(fā)現(xiàn)，CLT組織中浸潤淋巴細胞的CXCR3表達上調，與CXCL10結合后通過誘導Th1細胞的趨化作用，引起甲狀腺細胞的凋亡從而導致嚴重甲減［5］。Antonelli等研究表明CXCL10與甲減的相關性比甲狀腺自身抗體與甲減的相關性更強，CXCL10升高可能是甲狀腺炎活動程度的一個標志［6］。此外，本研究觀察到CXCL10在甲狀腺濾泡立方上皮細胞的胞漿中有明顯的表達，這提示甲狀腺濾泡立方上皮細胞在CLT的自身免疫中可能參與了局部趨化因子的合成以及炎癥細胞的募集。但CLT的CXCL10表達水平表現(xiàn)出明顯的個體差異，可能與患者的病程、病情、局部炎癥反應強度以及自身抗體水平等有關。

既往研究顯示慢性炎癥可通過觸發(fā)免疫抑制和破壞抗癌免疫反應從而導致腫瘤的發(fā)生與進展［7］。本研究結果顯示CXCL10在PTC組織中的表達水平顯著高于NG組織，甚至顯著高于CLT組織，這可能與PTC腫瘤微環(huán)境中淋巴細胞浸潤增加以及CXCL10基因的表達被激活有關。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞可通過自分泌或旁分泌方式產生趨化因子，與細胞表面相應受體結合，維持腫瘤細胞生長、促進血管增生，促進腫瘤細胞運動，獲得遠處轉移的能力。細胞實驗研究表明，CXCL10可能參與促進了惡性腫瘤的進展。PTC細胞中CXCL10的分泌明顯增加，與PTC的增殖與轉移相關［2，8］。在 PTC 中，RET 基因重排和BRAF/RAS基因突變均可激活CXCL10基因的轉錄，上調的CXCL10刺激了PTC的增殖和侵襲［3，9］。CXCL10 在肝移植后表達上調，誘導內皮祖細胞動員、分化和新生血管形成，進而促進肝癌生長。靶向抑制CXCL10/CXCR3信號可以預防移植后晚期肝癌復發(fā)和轉移［10］。此外，CXCL10表達的下調可抑制多種惡性腫瘤如黑色素瘤、結腸癌、和乳腺癌的遠處轉移率。這與本研究中CXCL10的表達水平與PTC的不良預后相關是一致的。CXCL10的這種促腫瘤機制可能與腫瘤特殊的微環(huán)境常導致浸潤的淋巴細胞免疫無有關，CXCL10招募Tregs細胞進入腫瘤微環(huán)境，阻斷NK細胞的功能，從而導致免疫抑制。此外，體外實驗表明CXCL10可顯著增加腫瘤微環(huán)境中的內皮祖細胞的濃度，促進內皮祖細胞的活化及分化，誘導血管形成［10］。但有趣的是，CXCL10及其受體CXCR3可能也具有一定的抗腫瘤作用。CXCL10能與CXCR3結合，誘導效應細胞CD4+/CD8+T細胞向腫瘤部位浸潤，誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長。CXCL10不僅可以與CXCR3結合介導細胞凋亡，也可與TLR4受體結合，使白激酶B及Jun氨基末端激酶的激活，導致caspase-8、caspase-3及p21-活化激酶2裂解使細胞凋亡。激活CXCR3受體可以進一步激活MAPK（ERK1/2 P38 JNK）、PI3K/Akt、ERK1/2、Akt等信號通路［11］。CXCL10這種不同的生物學效應可能與CXCL10受體類型（CXCR3A、CXCR3B和CXCR3-alt）的不同有關，這些配體在不同的細胞類型及疾病的不同階段中的表達不相一致。

AJCC癌癥分期系統(tǒng)是目前甲狀腺癌臨床診治中應用最為廣泛的預后評估的重要參考標準之一。本研究首次發(fā)現(xiàn)AJCCⅢ+Ⅳ期病例中CXCL10的表達水平顯著高于AJCCⅠ+Ⅱ期。進一步相關性分析結果顯示CXCL10的表達水平與PTC的甲狀腺包膜外侵犯相關，而與淋巴結轉移無明顯相關性，提示CXCL10可能主要參與PTC細胞的局部侵襲能力的調控，從而影響PTC患者的預后。Mulligan AM。等的研究發(fā)現(xiàn)，過表達CXCL10的乳腺癌細胞的培養(yǎng)基上清液可促進T淋巴細胞的遷移和浸潤［12］。因此，CXCL10在PTC中可能類似地通過旁分泌及自分泌作用影響腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤細胞的局部侵襲浸潤［13］。有研究者嘗試使用CXCL9/10/11的表達水平對腫瘤患者的預后風險進行系統(tǒng)評分［14］，我們的研究結果也證明了高水平的CXCL10與PTC的不良預后相關，因此未來CXCL10可能作為PTC潛在的生物標記物或預后指標。PTC和CLT之間的關系一直是眾多研究的焦點。Lee等人的一項大型薈萃分析顯示，與良性病變和不同腫瘤組織類型者相比，PTC患者出現(xiàn)CLT的頻率明顯更高。PTC合并CLT不僅與較低的甲狀腺外浸潤率和淋巴結轉移率相關，更重要的是與較低的復發(fā)率相關［15］。本研究中PTC中CXCL10的表達明顯高于CLT，CLT的免疫微環(huán)境是否影響PTC的發(fā)展和進展及其分子機制，仍是一個值得討論的問題。

綜上所述，與甲狀腺良性疾病相比，CXCL10在PTC組織中顯著高表達，可能促進了PTC的局部侵襲，與不良預后相關，可能作為潛在的生物標記物或預后指標。本研究亦首次從新的角度探索了CXCL10的表達與術前超聲征象的相關性，發(fā)現(xiàn)CXCL10的表達與術前超聲征象如病灶數(shù)量、大小、回聲、鈣化、血流情況，淋巴結大小、形狀、邊界、囊實性、鈣化均無顯著相關性。但作為單中心的回顧性研究，病例選擇可能存在一定偏倚。多中心、前瞻性研究、擴大樣本量，以及延長隨訪時間等將有助于進一步驗證本研究結果。對CXCL10的深入研究如CLT與PTC之間關系的探索、PTC中CXCL10與相關免疫微環(huán)境如免疫細胞、CXCL10-CXCR3信號通路的探索都將有助于深入闡明PTC的發(fā)生發(fā)展機制。