杜 軍,陳玉忠,李 雷,王 凱,馬家馳

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:tsmjc2013@163.com)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤,在亞太地區(qū)高發(fā),嚴(yán)重威脅我國胃癌患者的生命健康。積雪草酸(asiatic acid,Aa)是從傘形科植物積雪草中提取的一種三萜化合物。積雪草在傳統(tǒng)的中國和印度醫(yī)學(xué)中都具有很長的應(yīng)用史。之前的研究報(bào)道,積雪草酸具有多種藥理學(xué)作用,除了抗炎抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用之外[1-4],還具有抗腫瘤作用。例如,積雪草酸通過誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生誘導(dǎo)SK-MEL-2人黑素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[5],通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放和增加P53蛋白的表達(dá)抑制HepG2人肝癌細(xì)胞的增殖[6]。此外,積雪草酸還可以通過激活ERK和P38-MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯[7]。然而,積雪草酸對胃癌的抗腫瘤作用研究還尚未見報(bào)道。本研究重點(diǎn)考察了積雪草酸在體外對胃癌細(xì)胞的抗腫瘤作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 積雪草酸(asiatic acid,Aa)標(biāo)準(zhǔn)品購于美侖生物技術(shù)有限公司;伊利替康(CPT-11)、氯喹(chloroquine)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine)購于美國MedChemExpress有限公司;RPMI 1640含雙抗(100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)基購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;N-乙酰半胱氨酸(NAC)、RIPA裂解液(P0013C)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、MTT購于南京碧云天生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司;ECL發(fā)光液購于上海天能科技有限公司;cleaved Caspase3、cleaved Caspase9、cleaved PARP、LC3、P62、COXⅣ、Cytochrome C抗體購于美國Cell Signaling Technology股份有限公司;β-actin、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購于武漢愛博泰克(ABclonal Technology)生物科技有限公司。

1.1.2 細(xì)胞株 BGC-823和HGC-27人胃癌細(xì)胞細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀(BioTek公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司);微型離心機(jī)(Corning公司);CytoFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司);電泳儀(Bio-Rad公司);MicroChemi化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)(Azure公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823和HGC-27人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞存活率 將BGC-823和HGC-27人胃癌細(xì)胞均勻鋪于96孔板中,每孔約為1 000個(gè),細(xì)胞貼壁后給與不同濃度積雪草酸(25,50,100 μmol/L),每組5個(gè)復(fù)孔,置于孵箱繼續(xù)培養(yǎng)12,24,48,72 h,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT,4 h后吸走96孔板中液體,加入120-180 μl DMSO溶解沉淀,490 nm波長處測定其光吸收值,根據(jù)光吸收值換算出抑制率。

為了考察ROS在積雪草酸抑制BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞增殖的作用,同時(shí)給與5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸與積雪草酸,處理細(xì)胞24 h采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率。

為了考察自噬在積雪草酸抑制BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞增殖的作用,先用20 μmol/L氯喹和25 μmol/L 3-甲基腺嘌呤預(yù)先處理細(xì)胞2 h,再給與積雪草酸處理細(xì)胞24 h,再采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 取指數(shù)生長期的BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞,均勻鋪于6孔板中,約2×104個(gè)/孔,次日,加入不同濃度的積雪草酸(25,50,100 μmol/L)處理24 h,以10 μmol/L伊利替康(CPT-11)作為陽性對照,消化后500 r/min離心5 min,用PBS洗滌2次后加入500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,避光孵育5 min后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 線粒體/胞漿細(xì)胞組分提取分離 采用Thermo Scientific的Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells(貨號(hào)89874)進(jìn)行BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的線粒體/胞漿提取分離。適宜密度BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞均勻鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞貼壁后,給與積雪草酸處理24 h收集細(xì)胞,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行線粒體/胞漿的分離提取操作。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白與自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) ①收集細(xì)胞樣本,12 000g離心15 min后吸取上清置于另一干凈1.5 ml離心管中,加入1/4體積5×loading buffer,混勻后100 ℃處理5-10 min,置于-20 ℃?zhèn)溆?。②制備SDS-PAGE凝膠,根據(jù)待檢測蛋白的分子量和SDS-PAGE凝膠的最佳分子范圍選擇配制適合濃度的SDS-PAGE凝膠。③電泳,第一步電壓80 V,40 min,第二步電壓120 V,60 min。④濕轉(zhuǎn),根據(jù)待檢測蛋白的分子量決定濕轉(zhuǎn)時(shí)間,濕轉(zhuǎn)電壓維持在80 V以上。⑤封閉,非磷酸化蛋白采用5%脫脂奶粉室溫封閉1-2 h,磷酸化蛋白采用5% BSA室溫封閉1-2 h。⑥洗脫封閉液,加入一抗,包括cleaved Caspase3、cleaved Caspase9、cleaved PARP、LC3、p62、COXⅣ、cytochrome C、β-actin(5% BSA稀釋,稀釋比1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。⑦次日回收一抗,TBST洗膜,5 min×4次,加入二抗(5% BSA稀釋,稀釋比1 ∶5 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜,5 min×4次。⑧ECL發(fā)光液顯影。

1.2.6 ROS和GSH測定 ROS和GSH均采用碧云天的檢測試劑盒,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行測定。取對數(shù)生長期的BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞種植于96孔板中,約1 000個(gè)/孔,待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度積雪草酸(25,50,100 μmol/L)處理細(xì)胞24 h,以10 μmol/L伊利替康(CPT-11)作為陽性對照,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)的檢測操作。

2 結(jié)果

2.1 積雪草酸抑制BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,除了積雪草酸作用12 h,在24,48,72 h,積雪草酸濃度增加時(shí),BGC-823和HGC-27兩株胃癌細(xì)胞的存活率逐漸降低(P<0.05);且隨時(shí)間延長,BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的存活率也逐漸降低(P<0.05,見圖1)。積雪草酸對BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性,與0 μmol/L相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與0 μmol/L相比,*P<0.05;與0 h相比,#P<0.05

2.2 積雪草酸誘導(dǎo)BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡

流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨積雪草酸濃度增加,BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的凋亡率逐漸增加(見圖2)。BGC-823細(xì)胞分別加入25，50，100 μmol/L積雪草酸處理后，凋亡率分別為(10.37±4.35)%,(17.88±3.87)%,(25.66±5.66)%,陽性對照10 μmol/L伊利替康組的凋亡率為(12.86±3.22)%;HGC-27細(xì)胞分別加入25，50，100 μmol/L積雪草酸處理后，凋亡率分別為(13.89±3.34)%,(54.37±4.92)%,(69.14±5.25)%,陽性對照10 μmol/L伊利替康組的凋亡率為(24.76±3.67)%。與0 μmol/L相比，不同濃度積雪草酸作用于BGC-823細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。表明積雪草酸可以誘導(dǎo)兩株胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

與0 μmol/L積雪草酸相比,*P<0.05

2.3 積雪草酸激活線粒體凋亡途徑

由Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,隨著積雪草酸濃度的增加,BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞中cleaved Caspase 3、cleaved Caspase 9、cleaved PARP的表達(dá)也明顯增多(P<0.05,見圖3)。同時(shí),積雪草酸還增加了細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C(cytochrome C)的表達(dá)并減少了線粒體中細(xì)胞色素C的表達(dá)(P<0.05,見圖3),提示細(xì)胞色素C從線粒體中釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。以上結(jié)果說明,積雪草酸激活了BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞中的線粒體凋亡途徑。

與0 μmol/L相比,*P<0.05

2.4 積雪草酸促進(jìn)BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞中ROS的生成

結(jié)果顯示,隨著積雪草酸濃度的增加,BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞中ROS的水平增加,25,50,100 μmol/L積雪草酸處理BGC-823和HGC-27細(xì)胞24 h后,BGC-823胃癌細(xì)胞中ROS水平分別上調(diào)了1.26±0.35倍、1.82±0.21倍、2.07±0.25倍,陽性對照10 μmol/L伊利替康組上調(diào)了1.45±0.36倍;HGC-27細(xì)胞中ROS水平分別上調(diào)了1.25±0.08倍、1.71±0.19倍、1.89±0.23倍,陽性對照10 μmol/L伊利替康組上調(diào)了1.46±0.13倍,并且與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。還原性谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞中最重要的抗氧化物質(zhì)之一,25,50,100 μmol/L積雪草酸處理BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞24 h,BGC-823細(xì)胞中GSH相對水平分別為0.95±0.04,0.61±0.17,0.36±0.12,陽性對照10 μmol/L伊利替康組為0.68±0.31;HGC-27細(xì)胞中GSH的相對水平分別為0.93±0.02,0.51±0.10,0.25±0.03,陽性對照10 μmol/L伊利替康組為0.51±0.46,與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。這些結(jié)果表明積雪草酸誘導(dǎo)BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生。

ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)、積雪草酸(50 μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合處理BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞24 h,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,N-乙酰半胱氨酸減弱了積雪草酸的增殖抑制作用。在BGC-823細(xì)胞中,N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)組存活率為(103.24±5.33)%、積雪草酸(50 μmol/L)組存活率為(49.87±4.87)%、N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)+積雪草酸(50 μmol/L)組存活率為(91.27±4.79)%;在HGC-27細(xì)胞中,N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)組存活率為(102.31±3.42)%、積雪草酸(50 μmol/L)組存活率為(52.85±1.83)%、N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)+積雪草酸(50 μmol/L)組存活率為(88.64±0.99)%,且N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)+積雪草酸(50 μmol/L)組與積雪草酸(50 μmol/L)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。以上結(jié)果說明,積雪草酸通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)揮抗胃癌作用。

圖4 積雪草酸通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激抑制BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞增殖

2.5 積雪草酸誘導(dǎo)保護(hù)性自噬

線粒體損傷與自噬密切相關(guān),因此考察自噬是否參與了積雪草酸對BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖抑制。LC3-Ⅰ(19 kD)向LC3-Ⅱ(17 kD)的轉(zhuǎn)化以及P62的下調(diào)是自噬發(fā)生的重要標(biāo)志,Western blot結(jié)果顯示,積雪草酸濃度依賴性地抑制LC3-Ⅰ的表達(dá)并上調(diào)LC3-Ⅱ的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化。同時(shí)積雪草酸還抑制了P62的表達(dá),并且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5),提示積雪草酸可誘導(dǎo)BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬。MTT結(jié)果顯示,預(yù)先給與20 μmol/L氯喹或者25 μmol/L 3-甲基腺嘌呤自噬抑制劑抑制自噬的發(fā)生,與單獨(dú)積雪草酸處理相比,預(yù)先用自噬抑制劑處理的細(xì)胞生存率明顯降低,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。以上結(jié)果說明積雪草酸誘導(dǎo)BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。

與0 μmol/L相比,*P<0.05;與50 μmol/L相比,#P<0.05

3 討論

本研究通過考察積雪草酸對BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、ROS水平、GSH水平和自噬的影響,證實(shí)了積雪草酸可以抑制BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖,通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生激活線粒體途徑從而誘導(dǎo)BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時(shí)還可以誘導(dǎo)保護(hù)性自噬,積雪草酸聯(lián)合自噬抑制劑可以增強(qiáng)對BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的自主有序的死亡?？捎蓛煞N途徑介導(dǎo):一是TNF-α介導(dǎo)的死亡受體途徑,又稱外源性途徑,二是線粒體途徑,又稱內(nèi)源性途徑[8]。在受到凋亡刺激信號(hào)如ROS刺激時(shí),線粒體膜電位下降導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體中釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,并與Apaf-1結(jié)合形成復(fù)合物從而活化Caspase 9[9],進(jìn)而激活下游Caspase 3,執(zhí)行凋亡指令。積雪草酸促進(jìn)了Caspase 3、Caspase 9和PARP的剪切,以及線粒體中細(xì)胞色素C的釋放,證明積雪草酸通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,這與積雪草酸在其他腫瘤細(xì)胞中的作用相一致[10,11]。

自噬在化療導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞死亡中扮演著重要角色,自噬是一個(gè)涉及自噬通量的動(dòng)態(tài)過程,通過刺激自噬體形成,吞噬細(xì)胞內(nèi)容物,與溶酶體融合,導(dǎo)致內(nèi)容物的降解[12]。自噬既有積極的一面,也有消極的一面。一方面,它被視為一個(gè)生理過程,在細(xì)胞遇到饑餓或病原體感染等環(huán)境壓力時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用[13],另一方面,過度的自噬可以作為一種促死亡機(jī)制[14]。在BGC-823和HGC-27兩株胃癌細(xì)胞中,積雪草酸均促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化,證明了積雪草酸誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。此外,我們聯(lián)合了兩種自噬抑制劑氯喹和3-甲基腺嘌呤與積雪草酸一同作用BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)積雪草酸的抗胃癌增殖作用明顯增強(qiáng),從而證明積雪草酸誘導(dǎo)BGC-823和HGC-27胃癌細(xì)胞發(fā)生的自噬是保護(hù)性自噬。不僅如此，其他的一些臨床化療藥物也常常誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，抑制這種保護(hù)性自噬對增強(qiáng)化療效果具有重要意義[15-17]。

綜上所述,本研究證實(shí)了積雪草酸對胃癌細(xì)胞的殺傷作用,并提示了積雪草酸通過誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡從而抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)積雪草酸可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬,提示抑制該自噬對增強(qiáng)積雪草酸抗腫瘤療效的意義。