陳益勝 - 舒藍萍 - 徐學明 -1, 陳宗振 - 洪婷婷 - 黃彩虹 - 衛(wèi) 曉 陳啟飛 - 金亞美 -

(1.江南大學食品科學國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.連云港麥澤福食品有限公司，江蘇 連云港 251111)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)屬藜科，雙子葉植物。其種子呈扁平圓形狀，直徑約1.5～4.0 mm。根據(jù)藜麥種子天然色素(花青素或原花青素)種類和含量的不同，可分為白色、紅色和黑色3種類型。藜麥的各種營養(yǎng)成分全面且均衡，是目前已知的唯一一種能獨立供給人類正常營養(yǎng)需要的谷物；藜麥不含麩質(zhì)和類麩質(zhì)蛋白[1]，不會引起過敏；因其富含皂苷、黃酮、蛻皮激素、γ-氨基丁酸等生物活性物質(zhì)，常期食用可提高免疫力、降低患慢性疾病(心血管疾病、糖尿病、癌癥等)的風險[2]。為了宣傳藜麥的優(yōu)點和重要性，聯(lián)合國糧農(nóng)組織將2013年定為“國際藜麥年”[3]。藜麥不僅營養(yǎng)價值高且能在土壤鹽堿、酸性、干旱等各種脅迫條件下生長[4]，特別適宜中國西北高原地區(qū)的農(nóng)業(yè)環(huán)境。

發(fā)芽處理已成為谷物精深加工的一種重要手段。發(fā)芽是指種子吸水至一定程度，種子內(nèi)淀粉酶和蛋白酶等內(nèi)原酶被激活，淀粉、纖維和蛋白質(zhì)等被水解成小分子，種子的物理和生化特性發(fā)生顯著變化的生理生化過程[5]。發(fā)芽在提高谷物營養(yǎng)價值、改善理化特性的同時，降低了種子的抗營養(yǎng)因子含量[6]。目前，發(fā)芽作為一種加工手段已很好地應用于糙米且取得了一定的成果，如發(fā)芽糙米面包[7]、糙米飯[8]等。此外，課題組[9]前期研究表明，發(fā)芽還可以顯著提高薏米中γ-氨基丁酸、谷維素和VE等重要生物活性物質(zhì)的含量。馮煥琴等[10]研究了藜麥中的生物活性物質(zhì)含量，但藜麥發(fā)芽過程中生物活性物質(zhì)含量的變化尚未見報道。試驗擬以紅、黑、白3種主要藜麥的種子為原料，通過測定不同發(fā)芽時間段藜麥種子中的γ-氨基丁酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、皂苷、總酚含量，以及發(fā)芽期間藜麥種子的抗氧化性，研究其萌發(fā)過程中營養(yǎng)物質(zhì)和理化性質(zhì)的動態(tài)變化，旨在促進藜麥產(chǎn)品精深加工發(fā)展，提高其產(chǎn)品的經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秘魯黑藜麥、紅藜麥、白藜麥：市售；

DPPH、γ-氨基丁酸、齊墩果酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯：分析純，美國Sigma公司；

福林酚、沒食子酸：分析純，百靈威試劑公司；

恒溫恒濕箱：LHS-80HC-1型，上海一恒科學儀器有限公司；

凍干機：77530-30L型，照生有限公司；

高速粉碎機：600Y型，永康市鉑歐五金制品有限公司；

氨基酸自動分析儀：835-50型，日本日立公司；

旋蒸儀：RE-52型，上海亞榮生化儀器廠；

高效液相色譜：Agilent 1100型，美國安捷倫公司；

紫外—可見分光光度計：TU-1900型，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗方法

選擇籽粒飽滿、無霉爛和病蟲害的完整的黑、紅、白藜麥種子，在0.1%的NaClO溶液中浸泡30 min，用去離子水洗滌3次后，于25 ℃遮光條件下浸泡12 h，將浸泡后的藜麥種子置于培養(yǎng)皿上，于溫度25 ℃、濕度90%的恒溫恒濕箱中避光發(fā)芽。分別在發(fā)芽的0，12，24，36，48，60，72 h取樣，樣品凍干、粉碎、過篩后儲存于-20 ℃環(huán)境中備用。

1.3 檢測方法

1.3.1γ-氨基丁酸(GABA)的測定 參照文獻[11]。

1.3.2 表兒茶素的測定 準確稱取2.0 g發(fā)芽藜麥于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，室溫下超聲提取40 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液過0.45 μm微孔濾膜，定容于50 mL容量瓶中。采用HPLC系統(tǒng)對表兒茶素含量進行分析，HPLC系統(tǒng)選用C18柱，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，流動相為乙腈—0.5%乙酸，進樣量10 μL。

1.3.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯的測定 準確稱取2.0 g發(fā)芽藜麥于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，室溫下超聲提取40 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液過0.45 μm微孔濾膜，定容于50 mL容量瓶中。采用HPLC系統(tǒng)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量進行分析，HPLC系統(tǒng)選用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱，流動相為甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2，流速1.0 mL/min，檢測波長276 nm，柱溫24 ℃，進樣量10 μL。

1.3.4 皂苷的測定 參照文獻[12]。

1.3.5 總酚含量的測定 參照文獻[13]。

1.3.6 體外抗氧化性的測定

(1)DPPH自由基清除能力：將200 μL適當稀釋的樣品加入到3.8 mL 60 μmol/L DPPH溶液中，室溫下黑暗處反應60 min，于517 nm處測定吸光值。以甲醇溶液代替樣品作空白對照，按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

A——樣品與DPPH溶液反應后的吸光值；

B——空白對照(甲醇溶液)與DPPH反應后的吸光值；

(2)鐵離子還原能力(FRAP)：參照文獻[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計方差分析，結(jié)果以(均值±SD)表示。采用LSD法對試驗結(jié)果進行顯著性分析，P<0.05時表明存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-氨基丁酸含量的變化

γ-氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于動物和植物中的非蛋白氨基酸，是動物體內(nèi)不可或缺的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[15]。研究[16]表明，GABA在調(diào)節(jié)血壓、減輕焦慮、延緩記憶力衰退等方面有一定的促進作用。發(fā)芽是富集GABA的重要手段之一，楊天等[17]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)芽可使花生的GABA含量增加14.99倍；張穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)通過金屬離子脅迫萌發(fā)富集的小米糙米中的GABA含量可高達24.71 mg/100 g。由圖1可知，當發(fā)芽時間為0～48 h時，黑藜麥和紅藜麥的GABA含量均隨發(fā)芽時間的延長而增加，其中黑藜麥的GABA含量在發(fā)芽第48 h時達最大值，為未發(fā)芽時的7.10倍；當發(fā)芽時間為60 h時，紅藜麥的GABA含量相較于第48 h時有所下降，但在發(fā)芽第72 h時達最大值157.4 mg/100 g，為未發(fā)芽時的6.47倍；當發(fā)芽時間為0～48 h時，白藜麥的GABA含量有所降低，可能是GABA轉(zhuǎn)氨酶的酶活強于GABA合成的限速酶谷氨酸脫羧酶的酶活，但在發(fā)芽第60 h時大幅度增加，在發(fā)芽第72 h時達最大值，為未發(fā)芽時的6.40倍。發(fā)芽使得3個品種藜麥的GABA含量均有大幅度的增加，可能是由萌芽激活了谷氨酸脫羧酶引起的[19]。

2.2 表兒茶素含量的變化

表兒茶素是存在于植物中的含有多羥基的天然多酚物質(zhì)，多羥基結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)越的抗氧化能力[20]、抗炎作用[21]和抗腫瘤[22]等功能。由表1可知，未發(fā)芽藜麥中的表兒茶素含量為2.81～6.31 mg/100 g，發(fā)芽處理使藜麥中的表兒茶素含量增加，最高可達26.36 mg/100 g。黑藜麥的表兒茶素含量隨發(fā)芽時間的延長先增加后減少，在發(fā)芽第48 h時達最大值(26.36 mg/100 g)，為未發(fā)芽時的7.11倍；紅藜麥的表兒茶素含量隨發(fā)芽時間的延長先減少再增加，在發(fā)芽第12 h時達最大值(17.77 mg/100 g)；白藜麥的表兒茶素含量隨發(fā)芽時間的延長先減少后增加，在發(fā)芽第60 h時達最大值(14.68 mg/100 g)，為未發(fā)芽時的1.32倍。表兒茶素含量變化主要由CH4、CHI、PAL等主要代謝酶的酶活在萌芽過程中的變化所引起[23]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 The content ofγ-aminobutyric acid changed during the germination of quinoa

表1 藜麥發(fā)芽過程中表兒茶素含量的變化?

Table 1 The content of epicatechin changed during the germination of quinoa mg/100 g

發(fā)芽時間/h黑藜麥紅藜麥白藜麥03.25±0.35a2.81±0.28a6.31±0.44d1219.11±0.12d17.77±0.38g5.06±0.08c2421.76±0.37f15.37±0.19e3.50±0.14a3620.68±0.46e10.88±0.17c4.25±0.07b4826.36±0.19g9.83±0.24b6.03±0.23d6015.19±0.27c12.80±0.28d14.68±0.03f7213.16±0.23b16.66±0.05f12.94±0.20e

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量的變化

袁悅等[24]發(fā)現(xiàn)沒食子酸脂(EGCG)能延緩肌原纖維蛋白的變性和降解程度，延緩魚糜氧化變質(zhì)程度，有望成為一種新型的魚糜抗凍劑；李洋等[25]發(fā)現(xiàn)不同濃度EGCG處理對黃瓜種子萌發(fā)、主根伸長及側(cè)根的發(fā)生具有一定的濃度效應。由圖2可知，未發(fā)芽的黑、紅、白3種藜麥間EGCG含量差異不大。紅藜麥的EGCG含量隨發(fā)芽時間的延長而不斷升高，在發(fā)芽第72 h時達最大值17.14 mg/100 g。黑藜麥的EGCG含量隨發(fā)芽時間的延長先降低后增加，在發(fā)芽第48 h時達最大值23.81 mg/100 g。白藜麥的EGCG含量變化與黑藜麥的類似，呈先降低后增加的變化趨勢，白藜麥的EGCG含量在發(fā)芽第72 h時達最大值17.61 mg/100 g。植物代謝中，EGCG的上一級代謝產(chǎn)物為表沒食子兒茶素[26]，因此可通過測定藜麥萌發(fā)過程中表沒食子兒茶素含量以及表沒食子兒茶素轉(zhuǎn)化成EGCG反應中限速酶酶活的變化，探究藜麥發(fā)芽過程中EGCG含量變化的機理。

2.4 皂苷含量的變化

藜麥皂苷主要以三萜皂苷形式存在于種皮中，其含量為0.14%～2.30%。藜麥皂苷主要為齊墩果酸型、常春藤型、商陸酸型等[27]。由圖3可知，3種藜麥的初試皂苷含量為4.3～5.1 mg/g，與黃金等[28]的研究結(jié)果(5.56 mg/g)基本一致。黑藜麥與紅藜麥的皂苷含量均隨發(fā)芽時間的延長而增加，白藜麥的皂苷含量變化波動但較不顯著。黑藜麥的皂苷含量隨發(fā)芽時間的延長而增加，在發(fā)芽第72 h時達最大值(13.44 mg/g)，比未發(fā)芽時的增加了204.76%；紅藜麥的皂苷含量除發(fā)芽第24 h與第12 h相比有所降低外整體呈上升趨勢，在發(fā)芽第60 h時達最大值(8.96 mg/g)，比未發(fā)芽時的增加了106.23%；白藜麥的皂苷含量變化整體呈先降低后增加趨勢，在第36 h時達最低值(3.73 mg/g)，在第72 h時達最大值(5.72 mg/g)，比未發(fā)芽時的增加了11.39%。藜麥發(fā)芽過程中皂苷含量的增加，可能是不同酶系統(tǒng)的合成和激活促進了皂苷的生成，也可能是種子結(jié)構(gòu)的弱化增強了溶劑提取過程[29]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 The content of epigallocatechin gallate changed during the germination of quinoa

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Changes of saponins content during germination of quinoa

2.5 總酚含量的變化

由圖4可知，黑藜麥、紅藜麥、白藜麥的總酚含量變化大體一致，均隨發(fā)芽時間的延長而增加。黑藜麥的總酚含量在發(fā)芽過程中增加較均勻；紅藜麥的總酚含量發(fā)芽前60 h增加幅度較小，在發(fā)芽第72 h時迅速增加；白藜麥的總酚含量雖然也呈遞增趨勢但整體變化幅度不大。未發(fā)芽時，藜麥的總酚含量為1.2～1.4 mg GAE/g，三者總酚含量均在發(fā)芽第72 h時達最大值，分別比未發(fā)芽時增加了2.37，2.32，1.06倍。韓雅盟等[30]研究發(fā)現(xiàn)深色藜麥的酚類物質(zhì)及其抗氧化活性更高，且認為藜麥發(fā)芽過程中總酚含量增加是苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和細胞壁過氧化物酶等酶活性增加所引起的。

2.6 抗氧化活性的變化

2.6.1 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，3種藜麥的初試DPPH自由基清除能力存在一定差異，其中最低的為白藜麥(33.04%)，黑、紅藜麥的DPPH自由基清除率較高，分別為47.71%，51.40%。黑藜麥的DPPH自由基清除能力隨發(fā)芽時間的延長而遞增，在第72 h時達最大值(88.04%)，比未發(fā)芽時增加了84.53%；紅藜麥發(fā)芽前60 h時的DPPH自由基清除能力變化無明顯差異，在發(fā)芽第72 h時大幅度增加至92.61%；白藜麥的DPPH自由基清除能力在發(fā)芽前36 h隨發(fā)芽時間的延長而降低，在第36 h時達最低值，在第60 h時達最大值(40.48%)，比未發(fā)芽時增加了22.48%。綜上，發(fā)芽處理可提高谷物的DPPH自由基清除能力，不同顏色藜麥的增幅存在一定差異，與發(fā)芽可以增加藜麥的總酚含量有所關(guān)聯(lián)。藜麥的皂苷、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等含有羥基物質(zhì)的含量在發(fā)芽過程中有所增加，因此藜麥清除DPPH自由基的能力有所增加。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Changes in total phenolic content during germination of quinoa

2.6.2 鐵離子還原能力(FRAP) 由圖6可知，3種藜麥的鐵離子還原能力隨發(fā)芽時間的延長有不同程度的提高，表明發(fā)芽能提高藜麥的抗氧化性。紅藜麥的鐵離子還原能力在發(fā)芽第60 h時達最大值，比未發(fā)芽時增加了3.35倍；白藜麥的鐵離子還原能力在發(fā)芽第72 h時達最大值，比未發(fā)芽時增加了1.16倍；黑藜麥的鐵離子還原能力在發(fā)芽第72 h時達最大值，比未發(fā)芽時增加了2.62倍。吳鳳鳳等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)芽糙米相比，各階段的發(fā)芽糙米甲醇提取物的還原能力皆有不同程度的提高，與試驗結(jié)果類似。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 5 Changes of DPPH clearance rate during the germination of quinoa

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

黑、紅、白3色藜麥經(jīng)發(fā)芽處理后，生物活性成分(γ-氨基丁酸、皂苷、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和總多酚)含量和體外抗氧化活性(DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力)均有不同程度的提高，其中白藜麥的變化幅度均小于黑藜麥和紅藜麥的。黑藜麥和紅藜麥各指標的變化趨勢較一致，均隨發(fā)芽時間的延長而遞增。白藜麥發(fā)芽過程中各指標含量基本上隨發(fā)芽時間的延長先降低后升高，升高幅度不大。黑、紅、白3種藜麥的最佳發(fā)芽終止時間分別為48，72，72 h。后續(xù)可探索不同溫度與濕度對藜麥發(fā)芽的影響，縮短檢測的間隔時間，以期找到發(fā)芽過程中各種生物活性成分變化的機理。