田 瑩，檀 軍,2，趙 帥，郭建軍*

(1.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.遵義醫(yī)科大學(xué)，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州遵義 563000)

癌癥已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的頭號(hào)殺手，且發(fā)病率和死亡率急劇上升(毛艷艷等，2016)?！?018年全球癌癥報(bào)告》顯示，乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，新增發(fā)病人數(shù)約210萬人，發(fā)病率和死亡率分別占女性癌癥患者的24.2%和15%，高居首位(Brayetal.,2018)。乳腺癌的防控與治療形勢嚴(yán)峻。

昆蟲類中藥在治療腫瘤中發(fā)揮重要的作用(林璐璐等，2009)，九香蟲Aspongopuschinensis(Dallas,1851)即是其中一種(張?bào)业龋?011)。九香蟲始載于《本草綱目》，具有溫中助陽、理氣止痛的功效，是具有較高藥食兩用價(jià)值的昆蟲(蔡仁蓮等，2016)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明其可用于治療肝癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等(徐波等，2007；范欽等，2011；檀軍等，2013；楊佳琪等，2017；Tanetal.,2019)，也有抗菌和抗氧化等功效(中華本草編委會(huì)，1999；高穎暉等，2015)。

研究表明，九香蟲血淋巴具有抑制乳腺癌和胃癌細(xì)胞增殖的作用(檀軍等，2013；楊佳琪等，2017)，但九香蟲血淋巴提取工藝較復(fù)雜，穩(wěn)定性較差。九香蟲在臨床上的用藥形式主要為水煎液(劉慶芳，2002)，其制備工藝簡單，經(jīng)過高溫煎煮，藥物穩(wěn)定性較高，通過煎煮的方式可使藥物活性成分充分釋放和溶解于湯劑中。然而，高溫煎煮又可導(dǎo)致部分蛋白變性、物質(zhì)降解等，影響藥效，哪些物質(zhì)可能發(fā)揮主要的抗癌功效等仍然未知。因而本研究通過高溫煎煮九香蟲粉末，制備九香蟲水煎液，檢測其對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響，分析九香蟲水煎液主要成分，并討論分析其主要成分與其主要功效之間的關(guān)系，為九香蟲深層次開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

九香蟲(購自貴州省凱里市，置于恒溫干燥箱烘干備用)，人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453及小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑耗材

L-15培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國賽默飛公司)，胎牛血清(杭州四季青)，甲醇(德國CNW Technologies公司)，L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技公司)，0.22 μm針管式過濾器(美國密理博公司)，色譜柱(美國安捷倫公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

202型電熱恒溫干燥箱(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，超低溫冰箱(美國賽默飛公司)，Heraeus Fresco17離心機(jī)(美國賽默飛公司)，倒置相差顯微鏡(廈門麥克奧迪有限公司)，7890A氣相色譜儀(美國安捷倫公司)，PEGASUS HT質(zhì)譜儀(美國力可公司)，PS-60AL超聲儀(深圳雷德邦電子有限公司)，LNG-T98真空干燥儀(太倉華美生化儀器廠)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國賽默飛公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1樣品制備

九香蟲活蟲以純水清洗兩遍，濾紙吸干蟲體表面水分，置于電熱恒溫干燥箱中80℃烘烤4 h后研磨成粉末，稱取20 g蟲粉，加入80 mL純水，室溫浸泡30 min后于砂鍋中煎煮40 min，最后小火濃縮成濃度為0.5 g/mL的九香蟲水煎液。將九香蟲水煎液以6 000× g離心10 min，吸取上清液并用0.22 μm濾頭過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取200 μL九香蟲水煎液于1.5 mL離心管中，加入800 μL甲醇，再加入5 μL L-2-氯苯丙氨酸(1 mg/mL溶于純水中)作為內(nèi)標(biāo)，渦旋30 s。于-20℃條件靜置10 min，冰水浴條件下超聲5 min，以12 000× g離心15 min，小心吸取上清液 400 μL，在真空干燥儀中干燥。向干燥后的物質(zhì)加入甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL)，輕輕混勻后，放入烘箱中80℃孵育30 min。向每個(gè)樣品中加入BSTFA(含有1%TMCS，v/v)，將混合物70℃孵育1.5 h，隨機(jī)上機(jī)檢測。

1.4.2人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453細(xì)胞及小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-453使用含10%胎牛血清(FBS)，1%青鏈霉素混合液的L-15培養(yǎng)基，置于37℃，空氣相培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞使用含10%FBS，1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.3形態(tài)學(xué)觀察法及MTT法檢測九香蟲水煎液對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

使用0.25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-453、4T1細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組(無藥物組)及空白組(無細(xì)胞組)。用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基將九香蟲水煎液稀釋成生藥濃度梯度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，并用0.22 μm濾頭過濾除菌。24 h后，棄舊培養(yǎng)液，加入上述濃度梯度的水煎液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)。水煎液作用24 h后，利用倒置相差顯微鏡拍攝細(xì)胞形態(tài)圖。48 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO)，置于恒溫?fù)u床37℃震蕩10 min以徹底溶解紫色結(jié)晶。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長條件檢測吸光度(OD)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖率，增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100，并用SPSS 17.0分別計(jì)算九香蟲水煎液對(duì)兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4.4細(xì)胞劃痕法觀察九香蟲水煎液對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1細(xì)胞遷移的影響

取對(duì)數(shù)生長期的4T1細(xì)胞消化并接種于24孔板(細(xì)胞密度為4×104個(gè)/孔)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長90%融合時(shí)，用200 μL吸頭沿每個(gè)孔的中軸劃痕，劃痕后用無菌PBS洗滌3次。用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋九香蟲水煎液，加入水煎液濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。分別在0 h和24 h用倒置相差顯微鏡拍照，觀察各組細(xì)胞遷移情況，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Image J及SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞遷移率(%)=(0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/ 0 h劃痕寬度×100。

1.4.5GC-MS測定九香蟲水煎液主要成分

氣相色譜條件：采用DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純度氦氣，前進(jìn)樣口流速3 mL/min；柱流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。初始溫度50℃，持續(xù)1 min，然后以10℃/min的速率上升到310℃，保持8 min；質(zhì)譜條件：前進(jìn)樣口、傳輸線和離子源溫度是分別是280、280和250℃；離子源為EI；電子能量70 eV；質(zhì)譜數(shù)據(jù)在全掃描模式下獲得，質(zhì)量掃描范圍m/z為50～500。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)使用x±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 水煎液對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制的作用

不同濃度九香蟲水煎液作用于乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞24 h后，通過細(xì)胞形態(tài)觀察和MTT實(shí)驗(yàn)檢測九香蟲水煎液對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞增殖的抑制作用。MDA-MB-453細(xì)胞形態(tài)圖(圖1)顯示，0.04～0.10 g/mL濃度組細(xì)胞皺縮，體積變小，細(xì)胞貼壁能力降低，漂浮細(xì)胞較多，對(duì)照組和0.02 g/mL濃度組細(xì)胞呈飽滿的圓形，貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞輪廓清晰。

圖1 九香蟲水煎液作用24 h對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effects of Aspongopus chinensis decoction on the morphology of MDA-MB-453 cells for 24 h注：A-F分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL，200×。Note:A to F reflects 0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 g/mL,200×.

MTT檢測結(jié)果顯示，九香蟲水煎液可顯著抑制MDA-MB-453及4T1細(xì)胞的生長(P<0.05)。結(jié)果表明九香蟲水煎液具有抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1增殖的作用，且呈濃度依賴性，九香蟲水煎液作用于MDA-MB-453、4T1細(xì)胞的IC50濃度分別為0.034、0.101 g/mL。

圖2 九香蟲水煎液作用48 h對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞增殖的影響(P<0.05)Fig.2 Effect of Aspongopus chinensis decoction on the proliferation of MDA-MB-453 cells for 48 h(P <0.05)

2.2 九香蟲水煎液對(duì)4T1細(xì)胞遷移的影響

4T1劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組4T1細(xì)胞遷移率為42.67%±0.88%，濃度為0.02、0.04 g/mL水煎液作用于4T1細(xì)胞24 h后遷移率分別為18.33%±4.91%和8.67%±2.85%，加樣濃度為0.06、0.08、0.10 g/mL水煎液作用于4T1細(xì)胞24 h后大量細(xì)胞漂浮，呈彌散狀，無法測得遷移率。對(duì)照組遷移距離顯著大于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，表明九香蟲水煎液可顯著抑制4T1細(xì)胞的遷移能力。

圖3 九香蟲水煎液作用48 h對(duì)4T1細(xì)胞增殖的影響(P <0.05)Fig.3 Effect of Aspongopus chinensis decoction on the proliferation of 4T1 cells for 48 h(P <0.05)

圖4 九香蟲水煎液作用0 h和24 h對(duì)4T1細(xì)胞遷移影響的形態(tài)圖(40×)Fig.4 Morphological diagram of Aspongopus chinensis decoction on migration of 4T1 cells at 0 h and 24 h (40×)

圖5 九香蟲水煎液作用24 h對(duì)4T1細(xì)胞遷移的影響(P<0.05)Fig.5 Effect of the Aspongopus chinensis decoction on the migration of 4T1 cells at 0 h and 24 h (P<0.05)

2.3 GC-MS測定九香蟲水煎液主要成分

使用ChromaTOF軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分等分析(Kindetal.,2009)。根據(jù)離子流色譜圖(圖6)，使用PubChem和KEGG數(shù)據(jù)庫，包括質(zhì)譜匹配及保留時(shí)間指數(shù)匹配，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，共分析得出455種物質(zhì)。根據(jù)峰面積歸一化法得出各成分相對(duì)含量。根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配相似性≥800，篩選相對(duì)含量較高的20種化合物(表1)。其中，3,4-二羥基苯甲酸(0.88%)、尿苷(0.77%)、反丁烯二酸(0.72%)、腺苷(0.61%)、棕櫚酸(0.61%)等物質(zhì)可能與其能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖有關(guān)。

表1 九香蟲水煎液主要化合物成分Table 1 Main compound components of Aspongopus chinensis decoction

圖6 九香蟲水煎液總離子流量(TIC)圖Fig.6 Total ion flow diagram of Aspongopus chinensis decoction

3 結(jié)論與討論

3.1 九香蟲水煎液含有抗菌、抗氧化、鎮(zhèn)痛、助陽等活性成分

九香蟲水煎液GC-MS分析結(jié)果顯示，其中含量較多的物質(zhì)有反丁烯二酸、鳥氨酸、腐胺、瓜氨酸、3,4-二羥基苯甲酸、尿苷、腺苷、棕櫚酸等。反丁烯二酸具有鎮(zhèn)痛及抗菌的作用(吳素香等，2012；董璦榕等，2019)，鳥氨酸與瓜氨酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為精氨酸，精氨酸、腐胺具有提高精子活性的作用(Moralesetal.,2003)，這幾種物質(zhì)的作用與《本草綱目》所記載的九香蟲“理氣止痛，溫中助陽”之功效相符。3,4-二羥基苯甲酸廣泛存在于天然藥物中，具有抗菌、抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤的作用(Yinetal.,2009;Gutiérrez-Larraínzaretal.,2012;Palafox-Carlosetal.,2012;Deletal.,2014)，其抗菌和抗氧化的作用與中華本草編委會(huì)(1999)和高穎暉等(2015)結(jié)論一致。

3.2 九香蟲水煎液可抑制乳腺癌細(xì)胞體外增殖

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，九香蟲水煎液對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖與遷移具有顯著的抑制作用(如圖1～圖5)，結(jié)合GC-MS分析結(jié)果，在九香蟲水煎液中檢測到了反丁烯二酸、3,4-二羥基苯甲酸、腺苷、尿苷、棕櫚酸(如表1)。反丁烯二酸、3,4-二羥基苯甲酸具有抗腫瘤作用(Yinetal.,2009;吳素香等，2012)，腺苷是抗腫瘤核苷類的前體(劉洋等，2012)，尿苷可以調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的分化、增殖與凋亡(Mujoomdaretal.,2004)；棕櫚酸可抑制肝癌細(xì)胞增殖與促進(jìn)其凋亡(Nagataetal.,2015)。上述物質(zhì)均可能與九香蟲水煎液能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖有關(guān)。

九香蟲經(jīng)過高溫煎煮仍然具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的活性，通過GC-MS檢測，九香蟲水煎液主要成分中具有抗癌活性的成分較多，便于探究其藥理藥效和篩選抗癌活性成分。但九香蟲水煎液中具體是何種物質(zhì)起主要的抗腫瘤作用及其抗腫瘤的機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。本研究采用的4T1細(xì)胞系有很強(qiáng)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，可用于構(gòu)建乳腺移植瘤動(dòng)物模型，該模型的細(xì)胞生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與人類乳腺癌IV期十分相似，已被成功運(yùn)用到了惡性腫瘤治療藥物的研究中(Yangetal.,2012)，九香蟲水煎液可顯著抑制該細(xì)胞的增殖與遷移，可為后期探究九香蟲水煎液對(duì)小鼠乳腺癌的體內(nèi)抑制作用提供參考。