陶海平，曹 莉，韓日疇*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510640；2.廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣州 510260)

冬蟲夏草是青藏高原特有的名貴生物資源，由冬蟲夏草菌Ophiocordycepssinensis侵染蝙蝠蛾Thitarodes/Hepialus幼蟲形成的幼蟲尸體與真菌子座復(fù)合物(丘雪紅等，2016；韓日疇等，2019)。冬蟲夏草含有多種活性成分，如多糖、核苷、甾醇、蟲草酸等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗菌、抗腫瘤、護(hù)肝腎等廣泛藥理作用，與人參、鹿茸并稱“中藥三大寶”(Loetal.，2013；Zhouetal.，2014；丘雪紅等，2016；韓日疇等，2019)。

由于冬蟲夏草菌寄主單一，蝙蝠蛾幼蟲生長(zhǎng)期長(zhǎng)、生長(zhǎng)環(huán)境苛刻、加上人類過度采挖，野生冬蟲夏草日趨枯竭，現(xiàn)已被納入瀕危物種(李文佳等，2016)。為了滿足人們對(duì)冬蟲夏草的正當(dāng)需求，保護(hù)野生冬蟲夏草資源，人工培育是必由之路。于廣州低海拔實(shí)驗(yàn)室，從四川、云南、青海分離獲得的冬蟲夏草菌在米飯培養(yǎng)基中成功培育出具有子囊孢子的冬蟲夏草子實(shí)體(曹莉和韓日疇，2014；Caoetal.，2015)，這不僅為冬蟲夏草菌的產(chǎn)業(yè)化開辟了新途徑，同時(shí)直接證明了中國(guó)被毛孢Hirsurellasinensis為冬蟲夏草菌真正的無性型。菌株篩選、培養(yǎng)基組分、溫度以及誘導(dǎo)劑是冬蟲夏草子實(shí)體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子(韓日疇等，2019)。

冬蟲夏草菌在固體和液體培養(yǎng)基中可觀察到分生孢子、芽生孢子和菌絲。冬蟲夏草菌的最佳生長(zhǎng)溫度是18～20℃，溫度高于25℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)。最適的pH范圍為5～6；最佳碳源是葡萄糖，氮源是蛋白胨(王忠，2001a，b)。于液體培養(yǎng)基中麥芽糖比葡萄糖更有利于獲得高產(chǎn)量的芽生孢子(Liuetal.，2019)。冬蟲夏草菌液體培養(yǎng)參數(shù)包括接種量、溫度、pH、通氣等(李春如等，2004；劉欣等，2013；毛雄民等，2013；Meietal.,2013；賀宗毅等，2016；李婷婷，2017)。從新鮮冬蟲夏草不同部位分離得到的菌株在固體培養(yǎng)基上特性不同；單子囊孢子、雙子囊孢子和多子囊孢子菌株固體發(fā)酵時(shí)菌絲生長(zhǎng)旺盛，分生孢子產(chǎn)量顯著高于組織分離菌株(呂延華等，2016)。

不同菌株和培養(yǎng)基對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量影響顯著，如采自四川KD1202、云南的YN1202和青海的QH1208冬蟲夏草菌株在人工培養(yǎng)基上子實(shí)體出草率分別為50%～67%、30%～35%和3%～5%(Caoetal.，2015)。在食用菌或其它真菌子實(shí)體培養(yǎng)過程中，經(jīng)常使用安全的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如吲哚乙酸、赤霉素和2,4-二氯苯氧乙酸等提高子實(shí)體的產(chǎn)量(張慧鋒，2005；徐莉等，2008；李珍等，2016)。這些化學(xué)試劑通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和極性，以及促進(jìn)器官(如根、枝條、葉、花和果)發(fā)育發(fā)揮不同的作用，還調(diào)控植物各個(gè)生長(zhǎng)過程，以及與病原和共生菌的相互作用(Ludwig-Müller，2015；Fricketal.，2018)。國(guó)際上已把植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑應(yīng)用作為21世紀(jì)農(nóng)業(yè)實(shí)現(xiàn)超產(chǎn)的主要措施之一(朱杰麗等，2013)。

但是，目前冬蟲夏草子實(shí)體人工培養(yǎng)的參數(shù)仍未優(yōu)化。為了優(yōu)化人工培養(yǎng)參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定培養(yǎng)基中糖類和植物激素對(duì)冬蟲夏草子實(shí)體產(chǎn)量的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

冬蟲夏草菌種KD1223從中國(guó)四川省康定野生冬蟲夏草中采用常規(guī)方法分離、純化獲得(Caoetal.，2015)。以15%甘油貯存于-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑

Hipure Fungal DNA Mini Kit II試劑盒購(gòu)自Magen公司(中國(guó)，廣州)。氯仿、異丙醇、乙醇、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸銨、維生素B1、氯化鈉、酵母膏等購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；葡萄糖、蔗糖、購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，麥芽糖購(gòu)自BioForxx GmbH，蠶蛹粉購(gòu)自廣東信達(dá)繭絲綢股份有限公司。十種化學(xué)試劑如6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyl adenine，6-BA)、環(huán)磷腺苷(3′,5′-cyclic AMP)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、乙烯利(ethephon)、赤霉素(gibberellin acid，GA)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)、α-萘乙酸(α-Naphthalene acetic acid，α-NAA)、三十烷醇(triacontanol)和玉米素(zeatin)購(gòu)自Sigma公司。5%、15%、31%、50%的乙醇分別用于溶解α-NAA，吲哚乙酸、玉米素、吲哚丁酸、2,4-D，2%NaOH用于溶解6-BA，1%、4.8%的二甲亞砜(DMSO)分別用于溶解乙烯利、赤霉素，純氯仿用于溶解三十烷醇。配制的試劑在超凈工作臺(tái)上以細(xì)菌過濾器(0.22 μM，Gelman Sciences)過濾后使用。

1.2 培養(yǎng)基

固體LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉16 g/L，高壓蒸汽滅菌30 min。液體PPDA：每1 L水中加入200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，3 g磷酸二氫鉀，1.5 g硫酸鎂，20 mg維生素B1，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。固體PPDA：每1 L固體PPDA培養(yǎng)基在液體PPDA培養(yǎng)基加16 g瓊脂粉。PM液體培養(yǎng)基：每1 L水中加入200 g去皮土豆，20 g麥芽糖，10 g蛋白胨，3 g磷酸二氫鉀，1.5 g硫酸鎂，20 mg維生素B1，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

大米小麥培養(yǎng)基：100 mL的培養(yǎng)瓶中加入大米8 g、小麥8 g、蠶蛹粉0.4 g，營(yíng)養(yǎng)液22 mL；營(yíng)養(yǎng)液配方為每1 L營(yíng)養(yǎng)液中糖類20 g(葡萄糖、麥芽糖或蔗糖)，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，檸檬酸銨1 g，維生素B1 20 mg；將培養(yǎng)基組分加入100 mL的培養(yǎng)瓶中，室溫下浸泡1 h，然后121℃高壓滅菌1 h，冷卻至室溫備用。

1.3 菌種鑒定

以Hipure Fungal DNA Mini Kit II試劑盒提取液體PPDA培養(yǎng)基中(100 rpm，9～13℃)已培養(yǎng)30 d的冬蟲夏草菌DNA。以DNA為模板，參照冬蟲夏草菌通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′)、ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′)擴(kuò)增核糖體DNA(ITS；ITS1-5.8S-ITS2)序列(Caoetal.，2015)，以2×Easy Taq PCR Super Mix進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系(25 μL)：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，用ddH2O補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V，20 min)。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于NCBI中BLAST進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)構(gòu)建進(jìn)化樹證實(shí)比對(duì)結(jié)果。

1.4 子實(shí)體培養(yǎng)參數(shù)測(cè)定

本論文測(cè)定的培養(yǎng)參數(shù)包括營(yíng)養(yǎng)液中的糖類(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

總體培養(yǎng)方法如下：于超凈工作臺(tái)上將冬蟲夏草菌培養(yǎng)的子實(shí)體以無菌剪刀剪碎，再以無菌鑷子夾取2～3塊(長(zhǎng)約0.5 cm)加入液體PPDA培養(yǎng)基中，置于120 rpm搖床、9～13℃下培養(yǎng)60 d；以PPDA和LB平板檢測(cè)所培養(yǎng)的菌液是否被污染；從上述培養(yǎng)液中取1～3 mL轉(zhuǎn)接至新的液體PPDA培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)30 d。培養(yǎng)30 d的菌液稀釋一倍后，以每瓶12 mL量(每毫升含分生孢子3×109個(gè)，芽生孢子4.5×106個(gè))加入上述大米小麥培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶置于9～13℃下培養(yǎng)60 d，當(dāng)米飯小麥培養(yǎng)基表面菌絲全部覆蓋時(shí)，將培養(yǎng)瓶置于4℃下誘導(dǎo)原基分化，根據(jù)不同參數(shù)確定不同時(shí)間收獲子實(shí)體。

營(yíng)養(yǎng)液中加入不同糖類(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)的大米小麥培養(yǎng)基中接入PPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的菌液后，9～13℃下培養(yǎng)60 d，然后置于4℃下分別培養(yǎng)第9、10、11個(gè)月后收獲子實(shí)體，將收獲的子實(shí)體置于烘箱(80℃，5 h)烘干至恒重，記錄不同處理的子實(shí)體干重和每瓶的條數(shù)。該實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)14培養(yǎng)瓶，3個(gè)重復(fù)，共42瓶。每次隨機(jī)取樣4瓶，收獲子實(shí)體。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)子實(shí)體生長(zhǎng)影響測(cè)定步驟如下：將10 μL的各種化學(xué)試劑與12 mL菌液混合，使每毫升菌液中各種化學(xué)試劑的濃度分別為1 μg、10 μg或100 μg，然后分別加入含大米小麥培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。以菌液中分別加入5%、15%、31%、50%乙醇，2%NaOH，1%、4.8%DMSO，100%氯仿作為對(duì)照。按照上述方法培養(yǎng)，4℃培養(yǎng)后8個(gè)月采收子實(shí)體。該實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)14培養(yǎng)瓶，3個(gè)重復(fù)，共42瓶。每次隨機(jī)取樣10瓶，收獲子實(shí)體。

1.5 數(shù)據(jù)分析

不同處理下冬蟲夏草菌子實(shí)體的干重值以SPSS軟件(16.0 software，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行T檢驗(yàn)和方差分析。以Tukey進(jìn)行處理組之間多重比較。P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲夏草菌鑒定

以ITS4、ITS5引物對(duì)冬蟲夏草菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)與業(yè)已報(bào)道冬蟲夏草菌的序列(序列號(hào)：EU570927.1)(張倢，2016)相似度達(dá)99%，同時(shí)進(jìn)化樹也證明實(shí)驗(yàn)采用菌株為冬蟲夏草菌。

2.2 含糖培養(yǎng)基對(duì)子實(shí)體培養(yǎng)的影響

冬蟲夏草菌在大米小麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月之后檢查3種糖在培養(yǎng)基中菌絲的生長(zhǎng)狀況。葡萄糖培養(yǎng)基和蔗糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草菌菌絲已經(jīng)覆蓋培養(yǎng)基表面，呈灰白色；麥芽糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草菌菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲呈稀疏分布，處于米黃色狀態(tài)。說明冬蟲夏草菌在麥芽糖培養(yǎng)基中比在葡萄糖和蔗糖中的長(zhǎng)得慢。

培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入4℃下7個(gè)月進(jìn)行子實(shí)體第一次采收。葡萄糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實(shí)體長(zhǎng)勢(shì)最好，條數(shù)均值為每瓶8.33條，干重均值為0.4 g；麥芽糖和蔗糖培養(yǎng)基中均未長(zhǎng)出子實(shí)體。

培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入4℃下9個(gè)月后，對(duì)冬蟲夏草子實(shí)體進(jìn)行第二次采收。葡萄糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實(shí)體已完成生長(zhǎng)(子實(shí)體占滿培養(yǎng)瓶，且沒有白色氣生菌絲，圖1)，麥芽糖培養(yǎng)基中此時(shí)只有短小的子實(shí)體，說明葡萄糖培養(yǎng)基中子實(shí)體生長(zhǎng)比麥芽糖培養(yǎng)基中的快至少2個(gè)月；而蔗糖培養(yǎng)基中仍未長(zhǎng)出子實(shí)體且在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)出現(xiàn)大量的氣生菌絲。

圖1 培養(yǎng)基含葡萄糖冬蟲夏草菌子實(shí)體Fig.1 Medium containing glucose Ophiocordyceps sinensis fruiting body注：上圖為營(yíng)養(yǎng)液中含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)9個(gè)月的冬蟲夏草菌子實(shí)體。Note:The fruit body of Ophiocordyceps sinensis was cultured in glucose medium in nutrient solution for 9 months.

圖2 不同糖類培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實(shí)體干重差異Fig.2 The dry weight of Ophiocordyceps sinensis fruit body was different in different sugar medium注：圖為冬蟲夏草菌在營(yíng)養(yǎng)液中含有葡萄糖、麥芽糖、蔗糖的培養(yǎng)基中4℃下培養(yǎng)9個(gè)月后子實(shí)體干重差異。柱圖中不同字母表差異顯著(P<0.05,T test)。Note:Dry weights of fruiting bodies (at 4℃ after 9 months) of Ophiocordyceps sinensis from the media containing glucose (A);maltose (B);sucrose (C).Bars with different letters indicate significant difference (P<0.05,T test).

將收獲的子實(shí)體用烘箱(80℃，5 h)烘干至恒重。葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基的子實(shí)體干重顯著差異(t=3.17，df=5.148，P=0.024<0.05)(圖2)。培養(yǎng)基中含葡萄糖時(shí)冬蟲夏草子實(shí)體產(chǎn)量是麥芽糖的7.6倍，培養(yǎng)基中含蔗糖時(shí)未獲得任何子實(shí)體，盡管出現(xiàn)大量氣生菌絲。

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)子實(shí)體培養(yǎng)的影響

加入環(huán)磷腺苷、三十烷醇和玉米素的培養(yǎng)瓶均未發(fā)現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)，說明這些化合物強(qiáng)烈抑制冬蟲夏草菌的生長(zhǎng)。加入100 μg/mL 6-芐氨基腺嘌呤的培養(yǎng)瓶可見菌絲生長(zhǎng)，但未見原基分化。

加有1 μg/mL赤霉素或α-萘乙酸的培養(yǎng)瓶未長(zhǎng)出菌絲，但在加入濃度為10 μg/mL、100 μg/mL時(shí)均有菌絲長(zhǎng)出，似乎低濃度的赤霉素或α-萘乙酸對(duì)冬蟲夏草菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。2,4-D濃度為10 μg/mL、100 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)瓶中冬蟲夏草菌均未長(zhǎng)出菌絲，但加入濃度為1 μg/mL的培養(yǎng)瓶中菌絲生長(zhǎng)，說明10 μg/mL和100 μg/mL的2,4-D對(duì)冬蟲夏草菌生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，但1 μg/mL濃度支持菌絲生長(zhǎng)。

轉(zhuǎn)入4℃下6個(gè)月后，收獲子實(shí)體。各處理間子實(shí)體干重?cái)?shù)據(jù)單因素方差分析，結(jié)果顯示，8個(gè)不同種類和濃度的溶劑與對(duì)照均未見顯著差異(df1=7，df2=112，F(xiàn)=0.690，P=0.681)(P>0.05)(圖3)，說明不同種類和濃度的溶劑對(duì)冬蟲夏草子實(shí)體的生長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著影響；但是，各處理間差異顯著(df1=10，df2=153，F(xiàn)=32.927，P=0.000)(P<0.05)(圖4)。

圖3 不同種類和濃度的溶劑對(duì)冬蟲夏草子實(shí)體生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different kinds and concentrations of solvents on the growth of Ophiocordyceps sinensis fruiting body注：不同種類和濃度的溶劑(2%NaOH，5%、15%、31%和50%乙醇，1%、4.8%DMSO，100%氯仿)與對(duì)照(未加入任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和溶劑)培養(yǎng)瓶中冬蟲夏草子實(shí)體的干重。柱圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05,Tukey test) 。Note:Dry weights of fruiting bodies of Ophiocordyceps sinensis from the culture bottles containing different solvents (2%NaOH，5%、15%、31% and 50% ethanol，1%、4.8%DMSO，100%chloroform) and from the control (without any plant growth regulators or solvents).Bars with different letters indicate significant difference (P<0.05,Tukey test).

圖4 不同植物激素種類和濃度對(duì)冬蟲夏草子實(shí)體干重的影響Fig.4 Effects of different plant hormone types and concentrations on the dry weight of Ophiocordyceps sinensis fruit body注：圖為加入不同種類和濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實(shí)體干重的比較。IAA，吲哚乙酸；IBA，吲哚丁酸；GA，赤霉素；ETH，乙烯利；α-NAA，α-萘乙酸；2,4-D，2,4-二氯苯氧乙酸；CK，對(duì)照(未加入任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)。1，2，3表示濃度1 μg/mL，10 μg/mL和100 μg/mL。柱圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05，Tukey test)。Note:Dry weights of fruiting bodies of Ophiocordyceps sinensis from the media containing different kinds and concentrations plant growth regulators at three concentrations.IAA,indole-3-acetic acid;IBA,indole-3-butyric acid;GA,gibberellin acid;α-NAA,α-Naphthalene acetic acid;2,4-D,2,4-dichlorophenoxyacetic acid;CK,control (without any plant growth regulators).1,2,3 indicate the concentrations of 1 μg/mL,10 μg/mL or 100 μg/mL.Bars with different letters indicate significant difference (P <0.05,Tukey test).

與對(duì)照相比，加入100 μg/mL吲哚乙酸，1 μg/mL 和100 μg/mL吲哚丁酸，10 μg/mL赤霉素，1 μg/mL和10 μg/mL乙烯利，以及1 μg/mL 2,4-D的培養(yǎng)瓶中子實(shí)體干重均顯著提高(圖4)，其中加入1 μg/mL吲哚丁酸和1 μg/mL 2,4-D的培養(yǎng)瓶的子實(shí)體產(chǎn)量是對(duì)照的15倍。加入100 μg/mL赤霉素，100 μg/mL乙烯利以及10 μg/mL α-NAA-2的培養(yǎng)瓶子實(shí)體產(chǎn)量與對(duì)照的均沒有顯著差異。

可知吲哚乙酸在濃度范圍為1～100 μg/mL時(shí)，低濃度時(shí)對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量具有抑制作用，高濃度時(shí)具有促進(jìn)作用。吲哚丁酸在測(cè)定濃度范圍時(shí)均對(duì)冬蟲夏草子實(shí)體產(chǎn)量具有促進(jìn)作用(加入10 μg/mL的處理由于受到污染未獲得數(shù)據(jù))。當(dāng)赤霉素和乙烯利濃度為10 μg/mL時(shí)子實(shí)體產(chǎn)量最高。α-萘乙酸在低濃度和高濃度都表現(xiàn)出抑制作用，中間濃度未產(chǎn)生抑制和促進(jìn)作用。加入1 μg/mL 2,4-D對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量具有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，但濃度增加后產(chǎn)生抑制作用。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液中加入不同糖類時(shí)冬蟲夏草子實(shí)體干重葡萄糖>麥芽糖>蔗糖。各類糖如葡萄糖、麥芽糖和蔗糖等已廣泛用于真菌或食用菌子實(shí)體的培養(yǎng)。不同真菌最佳糖源多樣，如桑黃菌(蔗糖)(吳亞召等，2014)、白靈菇Pleurotusnebrodensis(可溶性淀粉)(李珍等，2015)、雙胞蘑菇Agaricusbisporus(麥芽糖)(張倢，2016)、秀珍菇Pleurotusgeesteranus(麥芽糖)(李碧瓊等，2017)、雞樅菌Termitomycesalbuminosu(蔗糖)(李艷麗，2018)和蛹蟲草Cordycepsmilitaris(蔗糖)(楊心如等，2019)。顯然，這與真菌的糖代謝能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，加入葡萄糖的大米小麥培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實(shí)體的生長(zhǎng)速率和干重顯著優(yōu)于麥芽糖培養(yǎng)基的。在液體培養(yǎng)基中，麥芽糖比葡萄糖更有利于獲得高產(chǎn)量的芽生孢子(Liuetal.，2019)。可能有利于芽生孢子生長(zhǎng)的麥芽糖不利于大米小麥固體培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實(shí)體的形成。有趣的是，與許多真菌不同，蔗糖不利于冬蟲夏草形成子實(shí)體，盡管在培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量氣生菌絲。誘導(dǎo)冬蟲夏草子實(shí)體形成的糖代謝通路值得進(jìn)一步研究。

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中1 μg/mL IBA和2,4-D對(duì)冬蟲夏草菌子實(shí)體生長(zhǎng)促進(jìn)效果最佳。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是包括人工合成的化合物和從生物中提取的天然植物激素，用于有效調(diào)節(jié)作物生育過程，達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、增強(qiáng)作物抗逆性等目的?？茖W(xué)研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用可使蔬果產(chǎn)量增加5%～30%(朱杰麗等，2013)。為避免食用過量，世界各國(guó)國(guó)均制定植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最大殘留限量值規(guī)定，如歐盟規(guī)定食用菌中多效唑、氣吡脲、抗倒酯、環(huán)丙酸酰胺的最大殘留限量值0.01 mg/kg，日本規(guī)定食用菌中氯苯胺靈的最大殘留限量值為0.02 mg/kg；我國(guó)和美國(guó)暫未有食用菌中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的限量規(guī)定(邱世婷等，2019)，盡管在果蔬上具有殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(朱杰麗等，2013)。

各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)真菌子實(shí)體的作用不同，如吲哚乙酸促進(jìn)粉被蟲草Cordycepspruinosa子實(shí)體生成，環(huán)磷腺苷(cAMP)增加鮮重(徐莉等，2008)；茉莉酸甲酯和吲哚乙酸能顯著縮短猴頭菇Hericiumerinaceus的生長(zhǎng)周期，赤霉素、萘乙酸及吲哚乙酸能顯著提高猴頭菇的產(chǎn)量(Thuan等，2017)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為利用安全的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)冬蟲夏草子實(shí)體人工培育提供的思路。