何軍

摘要：以商洛金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為材料，采用超聲輔助醇提取，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化金銀花綠原酸提取工藝。結(jié)果表明，商洛市金銀花綠原酸的最優(yōu)提取工藝為乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度65 ℃、料液比1∶40，綠原酸提取率可達(dá)4.305%。

關(guān)鍵詞：金銀花（Lonicera japonica Thunb.）;綠原酸;超聲輔助;工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS202.3? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）02-0145-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.032? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Process optimization of chlorogenic acid in honeysuckle of Shangluo

by ultrasound-assisted alcohol extraction

HE Jun

（Biopharmaceutical and Food Engineering College，Shangluo University，Shangluo 726000，Shaanxi，China）

Abstract： Aimed at probing a suitable extraction process for local production with the the honeysuckle of Shangluo city. Based on the alcohol extraction method， ultrasound-assisted extraction was carried out with the orthogonal test results on the basis of single factor test. The optimal extraction process of chlorogenic acid in honeysuckle of Shangluo were as followed ethanol mass fraction was 50%， ultrasonic time was 40 min， ultrasonic temperature was 65 ℃， solid-liquid ratio was 1∶40， the extraction rate of chlorogenic acid could be 4.305%.

Key words： honeysuckle; chlorogenic acid; ultrasound-assisted; process optimization

金銀花植株又名忍冬（Lonicera japonica Thunb.），是忍冬科忍冬屬多年生半常綠纏繞及匍匐莖的灌木，是常用大宗中藥材[1，2]。從其植株中分離出來(lái)有機(jī)酸[3]、黃酮[4]、揮發(fā)油[5]、多糖[6]等200多種化學(xué)成分，綠原酸是其中主要的有效成分[7-9]，在抗菌消炎方面有著重要的作用[10，11]，素有“中藥中的抗生素”之稱，綠原酸含量是衡量金銀花品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[12]。

金銀花在陜西商洛山區(qū)的分布十分廣泛，種植面積逐年擴(kuò)大，自2008年以來(lái)，以商州區(qū)、鎮(zhèn)安縣、柞水縣、山陽(yáng)縣、丹鳳縣為中心，在800～1 200 m區(qū)域的山坡地帶集中建立了13 333 hm2的金銀花基地，其中建立6 667 hm2的野生撫育基地。商洛市金銀花的收購(gòu)量占到全省總收購(gòu)量的50%以上[13]，是陜西省金銀花的第一主產(chǎn)區(qū)，包括金銀花在內(nèi)的“商藥”品牌正在成為商洛市的一張名片，正在扮靚商洛中藥產(chǎn)業(yè)，并輻射帶動(dòng)整個(gè)陜南地區(qū)及毗鄰省區(qū)中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展仍然以種植業(yè)為主，產(chǎn)品加工處于初級(jí)形態(tài)，工業(yè)規(guī)模小，加工工藝落后，商業(yè)也很薄弱，整個(gè)產(chǎn)業(yè)頭重腳輕，發(fā)展極不平衡，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)刂兴幃a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究以商洛市金銀花為材料，在傳統(tǒng)醇提取法的基礎(chǔ)上，采用超聲輔助處理，提取其有效成分，探索出一條既經(jīng)濟(jì)、高效，又適合商洛當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的提取工藝，以期為商洛金銀花資源的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)材料? 材料取自商洛市洛南縣麻坪鎮(zhèn)陳臺(tái)村，將其烘干粉碎后，過(guò)600目篩，備用。

1.1.2? 試劑? 綠原酸標(biāo)品HPLC≥99%，購(gòu)于成都埃法生物有限公司;無(wú)水乙醇（分析純），購(gòu)于成都化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3? 儀器? 750T型多功能中草藥粉碎機(jī)、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱、TP-214型電子精密天平、KQ5200E型超聲波處理器、UV755B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 提取工藝? 提取方法有傳統(tǒng)的水提法[14]、醇提法等[15]，新型微波輔助提取法[16]、超聲波法[17]、酶提法[18]、超臨界CO2流體萃取技術(shù)[19]等。

本研究采用超聲波法輔助提取的工藝，其流程為金銀花→干燥→粉碎處理→過(guò)600目篩→超聲波處理→過(guò)濾→4 000 r/min離心10 min→綠原酸粗提液→測(cè)定。

1.2.2? 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備? 準(zhǔn)確稱取5.5 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用80%乙醇溶液溶解轉(zhuǎn)移置100 mL的容量瓶中，以80%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻后可制得55 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。分別吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10 mL置于9個(gè)25 mL的容量瓶中，分別用80%乙醇溶液定容至刻度線處，搖勻，并以80%乙醇溶液為參照液，根據(jù)中國(guó)藥典（2015年版），綠原酸的吸收波長(zhǎng)最大為328 nm[20]，因此在324 nm處測(cè)定其吸光度，以吸光度A作為縱坐標(biāo)，以綠原酸濃度C作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，金銀花中綠原酸的提取率公式為：

W=×100%

式中，W為金銀花綠原酸的提取率（%）;C為綠原酸濾液稀釋后濃度;V為濾液的體積（mL）;N為稀釋倍數(shù);M為金銀花粉末的質(zhì)量（g）。

1.2.3? 單因素試驗(yàn)? 采用超聲波輔助法提取金銀花中總綠原酸，在超聲功率為200 W時(shí)，以乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，g∶mL）、超聲時(shí)間（5、10、20、30、40、50 min）、超聲溫度（5、20、35、50、65、80 ℃）作為主要的影響因子，研究其對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響。

1.2.4? 正交試驗(yàn)? 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9 （34）正交試驗(yàn)，以商洛金銀花綠原酸的提取率為檢測(cè)指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，吸光度A與綠原酸的濃度C滿足y=0.046 1x+0.008 3，R2=0.998 7，在5～20 μg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.2? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1? 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響? 設(shè)置超聲提取溫度50 ℃、超聲提取時(shí)間20 min、料液比1∶20，研究乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、30%、40%、50%、60%、70%對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～50%，金銀花中綠原酸提取率隨著乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大，當(dāng)乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，綠原酸的提取率最高，可能是因?yàn)榻疸y花中綠原酸的極性接近50%乙醇溶液的極性;隨著乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸增大，綠原酸提取率反而降低，可能是金銀花中的一些雜質(zhì)也溶于乙醇溶液，導(dǎo)致綠原酸提取率下降。故選取乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、50%、60%進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.2.2? 料液比對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響? 設(shè)置乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間20 min、超聲溫度50 ℃，研究料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60條件下對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可得，料液比會(huì)直接影響綠原酸類化合物的提取率，以剛好能浸沒(méi)原料的最少乙醇用量為基礎(chǔ)。結(jié)果表明，綠原酸提取率隨溶劑量增加而增加，當(dāng)料液比超過(guò)1∶40后，提取率增加的幅度不大，因此，取料液比為1∶30、1∶40、1∶50進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.2.3? 超聲時(shí)間對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響? 設(shè)置乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、超聲溫度50 ℃、料液比1∶20，研究超聲時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min條件下對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在10～40 min范圍內(nèi)金銀花中綠原酸提取率明顯增大，在40 min時(shí)提取率最高，達(dá)到2.160%，但當(dāng)提取時(shí)間大于40 min時(shí)，綠原酸提取率升高相對(duì)平緩，這是因?yàn)榻疸y花中的綠原酸已基本提出，延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)提取率沒(méi)有任何效果，使試驗(yàn)所需更多的時(shí)間。故選取超聲時(shí)間30、40、50 min進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.2.4? 超聲溫度對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響? 設(shè)置乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶20、超聲時(shí)間40 min，研究超聲溫度為5、20、35、50、65、80 ℃的條件下對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在5～65 ℃時(shí)金銀花中綠原酸的提取率隨著超聲溫度的升高而逐漸增大，因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)加快，導(dǎo)致細(xì)胞破裂速度加快，使金銀花中綠原酸的溶解及擴(kuò)散速度加快，提取率顯著提高。在超聲溫度為65 ℃時(shí)，金銀花中綠原酸的提取率最高。隨著溫度的升高，綠原酸提取率反而下降，可能是因?yàn)榻疸y花中綠原酸隨著溫度的升高部分有效成分被分解破壞，故選超聲溫度50、65、80 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.3? 正交試驗(yàn)結(jié)果

設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以商洛金銀花綠原酸的提取率為檢測(cè)指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由極差可以得出，商洛金銀花綠原酸提取率的主要影響因素順序?yàn)橐掖既芤嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)>料液比>超聲溫度>超聲時(shí)間，得出最優(yōu)提取組合為A2B2C2D2，即乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度65 ℃、料液比1∶40。以最優(yōu)參數(shù)進(jìn)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，綠原酸的提取率可達(dá)4.305%。

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。從表3的F檢驗(yàn)可以看出，A因素F0.01（2，2）

3? 小結(jié)與討論

優(yōu)化后的超聲輔助法提取工藝提取金銀花中綠原酸提取率可達(dá)4.305%，與孫文基[21]（采用水提法煎煮兩次，金銀花中綠原酸的總得率為0.5%）相比，采用超聲輔助法大大提高了提取效率;與宋德花等[14]的研究（采用水沉醇提法，控制料液比1∶40、煎煮2 h，確定為金銀花綠原酸的最佳提取工藝）相比，超聲輔助法作為一種新型的提取技術(shù)可大大縮短提取的時(shí)間。本研究提出的新工藝綜合成本低、污染較小、工藝簡(jiǎn)易、提取效率較高。超聲輔助法還可以有效地克服傳統(tǒng)煎煮法提取中藥材細(xì)粉易糊化、堵塞等問(wèn)題。因此，探索出一條經(jīng)濟(jì)、高效、適合商洛當(dāng)?shù)剡M(jìn)行大規(guī)模推廣和工廠化大生產(chǎn)的現(xiàn)代提取工藝就具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究以乙醇溶液為溶劑，利用超聲輔助法提取商洛金銀花中的綠原酸，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗(yàn)分析，得出商洛金銀花中綠原酸最佳提取工藝為乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度65 ℃、料液比1∶40、綠原酸的提取率可達(dá)4.305%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)科學(xué)院西北植物研究所.秦嶺植物志（第一卷第五冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，1985.

[2] 崔樹(shù)德. 中藥大全[M]. 哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

[3] IWANHASHI H，NEGOROY，IKEDA A，et al. Inhibation by chlorogenic acid of haematincatalysed retinoic acid 5，6-epoxidation[J].Biochemical journal，1986，239：641-646.

[4] 宋琳琳，冉軍艦，張曉娜.金銀花中總黃酮抗氧化性的研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（9）：1-2.

[5] 張? 玲，彭廣芳，鐘方曉，等.山東金銀花揮發(fā)油的化學(xué)成分分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1996，7（2）：89.

[6] 鄧慶華.用正交試驗(yàn)法優(yōu)化金銀花多糖提取工藝[D].長(zhǎng)春：東北師范大學(xué)，2008.

[7] 高玉敏，王名洲，王建平，等.金銀花化學(xué)成分的研究[J].中草藥，1995，26（11）：568.

[8] MARQUES V，F(xiàn)ARAH A. Chlorogenic acids and related compounds inmedicinal plants and infusions[J].Food chemistry，2009，113（4）：1370-1376.

[9] CLIFFORD M N，WU W G，KUHNERT N. The chlorogenic acids of Hemerocallis[J].Food chemistry，2006，95（4）：574-578.

[10] 徐躍成.金銀花中綠原酸的提取分離及其抑菌作用研究[D].重慶：重慶大學(xué)，2008.

[11] 李希賢，時(shí)常仁，孫奉先.金銀花等藥制菌作用的初步觀察[J].中華雜志，1995，41（10）：952.

[12] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2005版一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005，152-153.

[13] 李萬(wàn)波，程必勇，王桂山，等.金銀花本草考及陜西藥用品種與品質(zhì)評(píng)價(jià)[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985（1）：44-48.

[14] 宋德花，梁運(yùn)霞，劉廣文，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化金銀花中綠原酸水提醇沉工藝的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006， 5（1）：21-24.

[15] 劉冠明，朱麗琴，余土元，等.金銀花中綠原酸乙醇回流提取的條件優(yōu)化研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2005，25（3）：75-76.

[16] 李艷婷，周文富.金銀花中綠原酸的微博輔助提取工藝研究[J].化學(xué)與生物工程，2011，28（10）：65-69.

[17] 林云良，孫慶雷，祝? 賀，等.超聲波法提取金銀花中綠原酸工藝參數(shù)優(yōu)化研究[J].山東科學(xué)，2008，21（1）：25-27.

[18] 梅? 林.金銀花中綠原酸的酶法提取工藝優(yōu)化[J].廣州化學(xué)，2007，32（4）：30-34.

[19] 萬(wàn)? 強(qiáng)，許志杰，楊? 靖.超臨界CO2流體萃取金銀花的工藝研究[J].香料香精化妝品，2011（5）：19-21.

[20] 馮慧娟，吳利強(qiáng)，周海玲，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化金銀花中綠原酸的提取工藝[J].廣東化工，2017，44（8）：53-54.

[21] 孫文基.天然藥物成分提取分離與制備[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥出版社，2006.86-87.

收稿日期：2019-04-03

基金項(xiàng)目：商洛市2016年科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（sk2016-49）;商洛市2018年科技計(jì)劃項(xiàng)目（sk2018-23）

作者簡(jiǎn)介：何? 軍（1972-），男，陜西商南人，副教授，碩士，主要從事中藥材GAP生產(chǎn)以及植物營(yíng)養(yǎng)與施肥方面的教學(xué)與研究，

（電話）13991451660（電子信箱）slxyhejun3114@163.com。